用于冷冻生物溶液的装置和方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112804875 A(43)申请公布日 2021.05.14

(21)申请号 201980065699.0(22)申请日 2019.11.15(30)优先权数据

115153 2018.11.15 PT(85)PCT国际申请进入国家阶段日2021.04.02(86)PCT国际申请的申请数据

PCT/IB2019/059836 2019.11.15(87)PCT国际申请的公布数据WO2020/100105 EN 2020.05.22(71)申请人 斯玛特弗雷兹有限公司地址 葡萄牙萨尔武港

(72)发明人 安德烈亚·菲利帕·西尔韦斯特

雷·杜阿尔特　

鲁伊·德·布里托·埃斯特雷拉　()发明名称

用于冷冻生物溶液的装置和方法(57)摘要

本公开提供了在无菌条件下和在小体积容器中用于冷冻含有敏感物质如生物制药材料的液体混合物或悬浮液的系统和方法。公开的装置能够控制溶液的冰成核，最小化冻结的体积层，同时以自下而上的几何形状控生长速率，并且包括具有控制温度的装置的热传递表面(101)、用于多个容器(109)的支架(102)、用于将支架压靠在热传递表面以及任选的接触促进材料上的按压装置(103)。公开的方法包括将装置预冷却至基本上低于溶液成核温度的温度，将容器放置于支架中，使容器与热传递表面接触直到分数为10％的总样品体积被冻结；中断容器与热传递表面之间的接触；以预定冷冻速率使容器与热传递表面接触，使得生物溶液的冷冻是统一的；直到所有体积的溶液被冻结。

(74)专利代理机构 北京康信知识产权代理有限

责任公司 11240

代理人 李小爽(51)Int.Cl.

A01N 1/02(2006.01)

权利要求书2页 说明书12页 附图7页

CN 112804875 ACN 112804875 A

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1.一种用于使样品溶液以自下而上的几何形状冷冻和/或成核的方法，包括以下步骤：将装置预冷却至基本上低于溶液成核温度的温度，其中所述装置包括按压装置和底部热传递表面；

将包含生物溶液的容器放置于支架中，其中所述支架包括低热导率材料；使所述容器与所述热传递表面接触，直到分数为10％的总样品体积被冻结；中断所述容器与所述热传递表面之间的接触；

以预定冷冻速率使所述容器与所述热传递表面接触，使得所述生物溶液的冷冻是统一的；

直到所有体积的所述溶液被冻结。2.根据前一权利要求所述的方法，包括多个样品。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述容器内的所述生物溶液的受控冷冻速率为0.1℃/min‑100.0℃/min，优选0.5℃/min‑10℃/min，更优选1℃/min‑5℃/min。

其中预冷却所述装置的步骤在低于‑20℃、4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，

优选低于‑30℃、更优选低于‑40℃的温度下进行。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中中断所述容器与所述热传递表面之间的接触的步骤通过以下进行：优选地通过气隙，使所述容器离开所述热传递表面0.1mm直至15mm，同时将生物溶液保持在接近0℃的温度。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以预定冷冻速率使所述容器与所述热传递表面接触的步骤通过以下进行：通过将所述支架压靠在所述热传递表面上，使所述容器与所述热传递表面接触。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物溶液包括：微生物、组织、活细胞、干细胞、原代细胞、细胞系、活病毒或减毒病毒、核酸、单克隆抗体、多克隆抗体、生物分子、非肽类似物、肽、蛋白质、RNA分子、DNA分子、寡核苷酸、病毒颗粒或它们的混合物。

8.一种用于进行前述权利要求中任一项所述的方法的装置，包括：底部热传递表面；

包括至少一个用于容器的空腔的支架，其中所述支架包括低热导率材料；按压装置，配置为使所述容器与所述热传递表面接触，从而将热量从所述热传递表面传递到所述容器；移动所述容器离开所述热传递表面；以及使所述容器与所述热传递表面重新接触；

其中从所述容器的底部进行热传递，能够实现受控成核。9.根据前一权利要求所述的装置，其中所述按压装置包括用于抵靠所述支架的压缩机，使得在所述支架上施加均匀分布的压力，优选地其中在所述支架上施加手动或机械均匀分布的压力。

10.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述低热导率材料是塑料、陶瓷或复合材料。

11.根据前述权利要求中任一项所述的装置，包括至少一个容器。12.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述按压装置配置为：使容器的部分与所述热传递表面接触，从而将热量从所述热传递表面传递至所述容器的部分；移动所述容器离开所述热传递表面；以及重新使所述容器的部分与所述热传递表面接触，优选地其

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中所述容器的部分是容器底部。

13.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述支架包括选自弹簧、凸片或销的可压缩装置，使得所述支架在第一位置和第二位置之间是可压缩的，其中所述第一位置使容器底部与所述热传递表面接触且所述第二位置使所述容器底部离开所述热传递表面。

14.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述支架是在第一位置和第二位置之间的可压缩支架，其中所述第一位置使容器底部与所述热传递表面接触且所述第二位置使所述容器底部离开所述热传递表面。

15.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述支架压靠在所述热传递表面的平坦配置上。

16.根据前述权利要求1‑8中任一项所述的装置，其中所述支架压靠在所述热传递表面的刻制配置上，优选地其中所述热传递表面的刻制平台配置是深度为0.5‑3mm的凹陷。

17.根据前一权利要求所述的装置，其中所述热传递表面具有用于去除过量的液体、优选地用于去除过量的接触促进材料的通道。

18.根据前述权利要求中任一项所述的装置，包括按压装置框架，所述按压装置框架包括铰链和把手。

19.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述热传递表面由选自不锈钢、铜、铝或它们的混合物的传导材料制成。

20.根据前述权利要求中任一项所述的装置，包括用于储存冷却剂的冷却剂储存器。21.根据前述权利要求中任一项所述的装置，包括隔热框架，用于使所述热传递表面与室温隔热并且用于保护使用者。

22.根据前述权利要求中任一项所述的装置，包括翅片支撑件，用于在暴露区域内实现一致性热交换。

23.根据前一权利要求所述的装置，包括翅片，用于提供与冷却剂接触面积的增加。24.根据前述权利要求中任一项所述的装置，包括用于去除在所述热传递表面和所述容器之间的残留空气的接触层。

25.根据前一权利要求所述的装置，其中所述接触层是液体、糊剂、纸或贴纸，优选地其中，所述接触层的高度为0.1mm‑3mm。

26.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述容器的长径比高度/宽度大于1。27.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中容器壁和容器底部由不同的材料制成。

28.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中容器壁由聚合物、陶瓷、玻璃或其它低导热性材料制成。

29.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中容器底部由选自不锈钢、铝或其它材料的高传导率材料制成，或者使用诸如聚合物、玻璃或其它材料的低传导性材料构造。

30.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述装置是冷冻装置。31.一种根据前述权利要求中任一项冻结的生物溶液。

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用于冷冻生物溶液的装置和方法

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技术领域

[0001]本公开总体上涉及一种用于将包含敏感物质(例如生物材料)的液体混合物或悬浮液冷冻在多个小体积容器中的装置和方法，特别地其中生物材料是活细胞、血细胞、病毒、蛋白质、抗体等。此外，本公开改善了在多个容器中冷冻小体积的水性混合物期间成核和晶体生长的再现性。

背景技术

[0002]敏感物质的冷冻保存对于许多应用是必不可少的，与细胞生物学的开发有关。通常将其培养产生的细胞或衍生物冷冻保存，以管理生产和分配，包括储备用于保存其遗传物质。

[0003]现有系统的主要之一是由于与冷冻和解冻现象相关的复杂性导致的不一致。由于治疗和安全，这对于细胞疗法特别重要，其可能由于低效的冷冻保存而严重受损。[0004]冷冻保存涉及不同的过程，例如添加冷冻保护物质、冷却(冷冻)、加热(解冻)、混合，其决定了生物产品的物理化学稳定性。由于冷冻保存涉及一系列过程，因此不一致性很可能从最初(例如冷却和冷冻)到最后(例如解冻和混合)传递和放大。因此，最大化冷冻一致性对于最大化生物产品的整体保存至关重要。[0005]许多变量导致冷冻不一致，例如自然对流、成核温度、冰晶生长速率、过冷等。与冷冻一致性有关的两个主要问题是难以控制的，即自然对流和冰成核。

[0006]自然对流是发生在生物品的冷冻溶液中的溶质分布不均匀(低温浓缩或冷冻浓缩)的主要原因。已经显示出密度梯度驱动的对流是至关重要的，因为它使溶质向圆柱形容器底部和中心转移。据报道，通过使用非对流冷冻几何形状，即从底部到顶部单向冷冻，冰枝晶的形成会减弱自然对流，从而防止低温浓缩[1,2]。

[0007]冷冻保存的另一个关键方面是冰成核温度和位置的控制。在冷冻过程中，水溶液趋于在冰成核发生之前冷却至其熔点以下的温度，这种情况称为过冷。据描述，这对解冻后并因此在整个冷冻保存过程中的细胞存活力具有损害作用。为了减少过冷，已经提出了几种控成核的技术。就像将小的冰晶或冰的异质成核剂引入样品中一样；通过在低温容器外部手动产生冷点；通过电冷冻；通过机械方法(摇动、施加超声波)；通过冲击冷却或通过压致偏移[3]。

[0008]尽管已经开发了许多方法，但是大多数方法都难以标准化并且不能在无菌条件下以高水平的再现性整合到多个小体积容器中，确保在整个冷冻保存过程中的细胞活力和再现性。此外，已描述的提高冷冻一致性的大多数方法都已应用于大于10ml的体积。较大的体积可以更容易地控制热通量，这是由于较大的热传递面积和溶液的热惯性。相反，对于较小的体积(例如100μl)，进行必要的控制以实现小瓶底部的局部成核，同时不损害单向自下而上的冷冻面临一些技术挑战。

[0009]与冷冻系统相关的问题之一是关于成核温度的再现性和第一冰晶在多个小瓶的批次中的位置的难于控制。这种可变性可能导致小瓶之间的性质不统一，其最终将导致细

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胞保存质量的变动。在本公开中遵循的方法涉及通过容器底座(底部，base)的快速冷却来增强成核。为了在底座上实现快速冷却，必须最小化通过底部的容器的耐热性。这可以通过使用传导材料(例如冰点低于水的液体、聚合物、糊剂(糊，paste)或贴纸)来实现，其可改善热传递板与容器底部之间的接触，即其最小化两个表面内的空气。Rosa等人[2]遵循该策略进行冷冻干燥应用，其中将粘合剂材料附着到容器底部，以减少由典型的玻璃小瓶凹度形成的气隙，因此将热传递系数提高了近2倍。尽管是有效的，但Rosa等人[2]遵循的策略需要对小瓶设计进行重大修改，这意味着许多构造复杂性和监管机构的验证。例如，粘合剂材料可以是洁净室中污染物的来源，并且还可以与用于冷冻保存细胞的容器的制造中使用的典型材料反应。另一个重要的技术困难导致能够控制成核和冰生长速率。在较小的体积中，需要底座的快速冷却以增强底部的成核，可能导致样品完全不受控制地冷冻，而不仅仅是成核。当溶液的质量较小时，例如小于容器的质量时，热惯性可以控制冷冻过程的动力学。发明内容

[0010]理想地，为了使成核与受控速率的冷冻分离，成核过程中冻结的液体分数应不高于20％，优选低于10％，以确保大多数样品在自下而上的方向以受控速率冷冻。因此，底部的冷却应强烈而短暂，以使溶液成核，同时减小在过冷条件下不可控制地冷冻的体积层。这可以通过将容器底座急剧冷却至相当低的温度(通常低于‑40℃)来实现，例如，通过将容器放在冷表面的顶部上。然而，为了在多个容器的批次中实现一致的成核，两个条件很关键：a)将所有容器同时放置在预先冷却的热传递表面上，以及b)容器底部与热传递表面之间的接触是等效的，不管粗糙度变化如何。随着容器底部面积变小，粗糙度变化很可能导致较大的不一致性。为了使成核与冰生长速率分离，在单向几何形状中，期望长径比高度/宽度不小于1，以在成核事件之前通过热扩散最小化过冷的液体的高度，从而与不受控制地冷冻相比减小样品体积。因此，用于单向冷冻的容器可以在底部具有小面积可能是方便的，由于例如在小于2ml的体积中典型的粗糙度变化，这可以使热传递一致性变得复杂。此外，期望只有一小部分样品过冷(最高为20％)，而剩余液体高于冷冻温度(接近0℃)，以避免成核后大量冰生长。其否则会导致大部分样品(大于20％)的不受控制地冷冻。[0011]晶核的产生意味着在新相的边界处形成界面。冷却到最大异相成核温度(熔化温度)以下但高于均相成核温度(纯物质冷冻温度)的液体称为过冷。[0012]本公开旨在解决上述问题。

附图说明

[0013]当结合附图阅读时，根据以下详细描述，本公开的这些和其它目的、特征和优点将变得明显。

[0014]为了更容易地理解本公开，将附图结合起来，这些附图表示本公开的优选实施方

这些实施方式并不旨在本申请的目的。式，然而，

[0015]图1示意性地示出了压力器(press)被向下锁定时的冷冻装置的实例的总体立体图，其中附图标记指示：100‑冷冻头；101‑热传递表面；102‑支架(容器架，holder)；103‑按压装置；104‑按压装置框架；105‑把手(扶手，handler)；106‑铰链；107‑枢轴；108‑压缩机。[0016]图2示意性地示出了压力器未锁定时的冷冻装置的实例的总体立体图，其中附图

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标记指示：100‑冷冻头；101‑热传递表面；102‑支架；103‑按压装置；104‑按压装置框架；105‑把手；106‑铰链；107‑枢轴；108‑压缩机；109‑容器。

[0017]图3示意性地示出了冷却系统内的冷冻装置的实例的总体立体图，其中附图标记指示：102‑支架；110‑系统；111‑隔热框架(隔离框，insulation frame)；112‑翅片支撑件；113‑冷却剂储存器。

[0018]图4示意性地示出了冷冻装置的实例的总体立体图，其中附图标记指示：102‑支架；111‑隔热框架；112‑翅片支撑件；114‑系统；115‑翅片。[0019]图5示意性地示出了热传递表面的两个实例，其中附图标记指示：101a‑平坦配置；101b‑凹槽(凹陷，凹部，recess)配置；116‑通道；117‑热传递表面的凹槽。[0020]图6示意性地示出了支架配置的实例，其中附图标记指示：102a‑具有弹簧配置的可压缩装置；118‑弹簧；119‑接触层。

[0021]图7示意性地示出了支架配置的实例，其中附图标记指示：102b‑具有凸片配置的可压缩装置；119‑接触层；120‑凸片。

[0022]图8示意性地示出了支架配置的实例，其中附图标记指示：102c‑具有销配置的可压缩装置；109‑容器；119‑接触层；121‑销。

[0023]图9示意性地示出了容器配置的实例，其中附图标记指示：109‑容器；122‑容器壁；123‑容器底部。

[0024]图10示出了在热传递表面(图5所示)中使用(黑线)或不使用(虚线)接触促进材料对设置有根据前面公开的实施方式的装置的含10％海藻糖的水溶液的成核时间的影响。[0025]图11示出了在热传递表面(图5所示)中使用(黑线)或不使用(虚线)接触促进材料对设置有根据前面公开的实施方式的装置的含10％DMSO的水溶液的成核时间的影响。具体实施方式

[0026]在本公开中，单向几何形状是指沿轴的单向温度梯度的产生，其引起冰峰(冰前沿，ice‑front)沿所选轴形成和发展。特别地，单向自下而上的几何形状是指沿垂直轴的单向温度梯度的产生，其引起冰峰从底部到顶部形成和发展。[0027]在本公开中，受控成核是指在容器与热传递表面接触之后的短时间间隔内、优选地小于一分钟内形成第一冰晶。它具体地发生在容器底部表面，并且在成核后立即冻结(由于局部过冷)的液体分数不应高于20％。[0028]在一个实施方式中，冷冻是从容器底部到顶部的单向冷冻。由于具有低热导率材料的支架的隔热作用，因此冷冻以受控的方式实现，并且当与其它类似技术相比时，本公开的优点之一是冷冻不是径向冷冻。因此，无论样品的总体积如何，小瓶内容物的冷冻是可控、统一(一致，同质，homogeneous)且更有效的。

[0029]由本发明的方法提供的出乎意料的效果之一是，冷冻在相同冷冻循环的小瓶之间是统一的。这意味着每个小瓶的内容物被一致性(uniformly)冷冻，并以与相同冷冻循环的其它小瓶相同的方式冷冻。另外，不管小瓶包含1μl溶液还是100ml溶液，冷冻效力都较高。[0030]在另一个实施方式中，本公开涉及一种用于冷冻生物溶液的装置，该装置包括：[0031]热传递表面(101)；[0032]支架(102)，其包括至少一个用于生物溶液的容器(109)的内腔；

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按压装置(103)，用于将支架(102)压靠在热传递表面(101)上，其中该按压装置配

置为：使容器(109)与热传递表面(101)接触，从而将热量从热传递表面(101)传递到容器(109)并能实现受控成核，移动容器(109)离开热传递表面(101)，以及重新使容器(109)与热传递表面(101)接触；

[0034]使得生物溶液的冷冻具有自下而上的几何形状。[0035]在一个实施方式中，按压装置(103)可以包括用于抵靠支架(102)的压缩机(108)，使得在支架(102)上施加均匀分布的压力，优选地其中在支架(102)上施加手动或机械均匀分布的压力。

[0036]在一个实施方式中，支架(102)可由低热导率材料制成，优选地且为了获得更好的结果，低热导率材料是塑料、陶瓷或复合材料。[0037]在一个实施方式中，本公开的装置包括至少一个容器(109)。[0038]在一个实施方式中，按压装置配置为：使容器的部分(123)与热传递表面(101)接触，从而将热量从热传递表面(101)传递至容器的部分(123)；移动容器(109)离开热传递表面(101)，以及重新使容器的部分(123)与热传递表面(101)接触，优选地其中容器的部分是容器底部。

[0039]在一个实施方式中，支架(102)可以包括选自弹簧(118)、凸片(120)或销(212)的可压缩装置(102a、102b、102c)，使得支架(102)在第一位置和第二位置之间可压缩，其中第一位置使容器底部(123)与热传递表面(101)接触，且第二位置使容器底部(123)离开热传递表面(101)。

[0040]在一个实施方式中，支架(102)可以是在第一位置和第二位置之间可压缩的可压缩支架，其中第一位置使容器底部(123)与热传递表面(101)接触，且第二位置使容器底部(123)离开热传递表面(101)。[0041]在一个实施方式中，可以将支架(102)压靠在热传递表面(101)的平坦配置(结构，configuration)(101a)上。[0042]在一个实施方式中，可以将支架(102)压靠在热传递表面(101)的凹槽配置(101b)上，优选地其中热传递表面(101b)的凹槽(117)是深度为0.5‑3mm的凹陷。[0043]在一个实施方式中，优选地去除多热传递表面(101)可以是用于去除多余的液体、余的接触促进材料的通道(116)。[0044]在一个实施方式中，通道(116)可具有0.5‑3mm的深度和1‑5mm的宽度。[0045]在一个实施方式中，本公开的装置还可以包括按压装置框架(104)，其中按压装置框架(104)包括铰链(106)和把手(105)。[0046]在一个实施方式中，热传递表面(101)可以由选自不锈钢、铜、铝或其混合物的传导(导热，conductive)材料制成。[0047]在一个实施方式中，该装置还可以包括用于储存冷却剂的冷却剂储存器(113)。[0048]在一个实施方式中，该装置还可以包括用于将热传递表面与室温隔热并保护使用者的隔热框架(111)。

[0049]在一个实施方式中，该装置还可以包括用于实现一致性热交换的翅片支撑件(112)。

[0050]在一个实施方式中，该装置还可以包括用于提供与冷却剂的更大接触面积的翅片

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在一个实施方式中，该装置还可以包括接触层(119)，用于去除热传递表面(101)

和容器(109)之间的残留空气，优选地其中接触层(119)是液体、糊剂、纸或贴纸，优选其中接触层(119)的高度为0.1mm‑3mm。[0052]在一个实施方式中，容器(109)可以具有5‑50mm的高度和4‑10mm的直径。[0053]在一个实施方式中，容器可具有大于1的长径比高度/宽度。[00]在一个实施方式中，容器壁(122)可具有0.4‑2mm的厚度，且容器底部(123)具有0.2‑2mm的厚度。

[0055]在一个实施方式中，容器壁(122)和容器底部(123)由不同的材料制成。[0056]在一个实施方式中，容器壁(122)由聚合物、陶瓷、玻璃或其它低导热材料制成。[0057]在一个实施方式中，容器底部(123)由诸如不锈钢、铝或其它材料的高传导率材料制成，或者使用诸如聚合物、玻璃或其它材料的低传导性材料构造。[0058]在一个实施方式中，该装置是冷冻装置。

[0059]本公开还涉及一种用于操作本公开的装置的方法，包括以下步骤：[0060]预冷却装置；

[0061]将含有生物溶液的容器(109)放入支架(102)中；

[0062]使用按压装置(103)使容器底部(123)与热传递表面(101)接触，移动容器(109)使其不与热传递表面(101)接触；

[0063]使用按压装置(103)重新使容器底部(123)与热传递表面(101)接触；[00]设置受控的冷冻速率，使得生物溶液的冷冻具有自下而上的几何形状。[0065]在一个实施方式中，所述容器内的生物溶液的所述受控冷冻速率可以为0.1℃/min‑100.0℃/min，优选0.5℃/min‑10℃/min，更优选1℃/min‑5℃/min。[0066]在一个实施方式中，预冷却装置的步骤可以在温度低于‑20℃、优选低于‑30℃、更优选低于‑40℃下进行。

[0067]在一个实施方式中，移动容器(109)离开热传递表面(101)的步骤可以通过使容器(109)离开热传递表面(101)0.1mm直至15mm，优选地通过气隙来进行，同时将生物溶液保持在接近0℃的温度。

[0068]在一个实施方式中，使容器(109)与热传递表面(101)重新接触的步骤可通过将支架(102)压靠在热传递表面(101)上从而使容器(109)与热传递表面(101)接触来进行。[0069]在一个实施方式中，生物溶液可以包括：微生物、组织、活细胞、干细胞、原代细胞、细胞系、活病毒或减毒病毒、核酸、单克隆抗体、多克隆抗体、生物分子、非肽类似物、肽、蛋白质、RNA、DNA、寡核苷酸、病毒颗粒或其混合物。

[0070]本公开还涉及根据本公开的方法冷冻的生物溶液。[0071]在一个实施方式中，本公开涉及一种用于使样品溶液以自下而上的几何形状冷冻

包括以下步骤：和/或成核的方法，

[0072]将装置预冷却至基本上低于溶液成核温度的温度，其中该装置包括按压装置和底部的热传递表面；

[0073]将包含生物溶液的容器放入支架中，其中该支架包括低热导率材料；[0074]使该容器与该热传递表面接触，直到总样品体积的10％的部分冻结；

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中断该容器与该热传递表面之间的接触；

[0076]以预定冷冻速率使该容器与该热传递表面接触，使得生物溶液的冷冻是统一的；[0077]直到所有体积的溶液冻结。[0078]在另一个实施方式中，本公开涉及包括多个样品。[0079]在其它实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述容器内的生物溶液的受控冷冻速率为0.1℃/min‑100.0℃/min，优选0.5℃/min‑10℃/min，更优选1℃/min‑5℃/min。[0080]在其它实施方式中，本公开涉及一种方法，其中预冷却装置的步骤在低于‑20℃、优选低于‑30℃、更优选低于‑40℃的温度下进行。[0081]在其它实施方式中，本发明涉及一种方法，其中中断容器和热传递表面之间的接触的步骤通过使容器离开热传递表面0.1mm直至15mm，优选地通过气隙来进行，同时将生物溶液保持在接近0℃的温度。[0082]在其它实施方式中，本发明涉及一种方法，其中通过将支架压靠在热传递表面上从而使容器与热传递表面接触来进行以预定冷冻速率使容器与热传递表面接触的步骤。[0083]在其它实施方式中，本公开涉及一种方法，其中生物溶液包括：微生物、组织、活细胞、干细胞、原代细胞、细胞系、活病毒或减毒病毒、核酸、单克隆抗体、多克隆抗体、生物分子、非肽类似物、肽、蛋白质、RNA分子、DNA分子、寡核苷酸、病毒颗粒或其混合物。[0084]在其它实施方式中，本公开涉及一种用于使样品溶液以自下而上的几何形状冷冻和/或成核的装置，包括：[0085]底部的热传递表面；

[0086]包括至少一个用于容器的空腔的支架，其中该支架包括低热导率材料；[0087]按压装置，其配置为使容器与热传递表面接触，从而将热量从热传递表面传递到容器；将移动容器离开热传递表面；以及使容器与热传递表面重新接触；[0088]其中热传递从容器底部进行，能够实现受控成核。[00]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中按压装置包括用于抵靠支架的压缩机，使得在支架上施加均匀分布的压力，优选地其中在支架上施加手动或机械均匀分布的压力。

[0090]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中低热导率材料是塑料、陶瓷或复合材料。

[0091]在其它实施方式中，本公开涉及一种包括至少一个容器的装置。[0092]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中按压装置配置为：使容器的部分与热传递表面接触，从而将热量从热传递表面传递至容器的部分；移动容器离开热传递表面；以及重新使容器的部分与热传递表面接触，优选地其中容器的部分是容器底部。[0093]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中支架包括选自弹簧、凸片或销的可压缩装置，使得支架在第一位置和第二位置之间可压缩，其中第一位置使容器底部与热传递表面接触，且第二位置使容器底部离开热传递表面。[0094]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中支架是在第一位置和第二位置之间的可压缩支架，其中第一位置使容器底部与热传递表面接触，并且第二位置使容器底部离开热传递表面。

[0095]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中支架压靠在热传递表面的平坦配

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置上。

在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中支架压靠在热传递表面的刻制配

置上，优选地其中热传递表面的刻制平台配置是深度为0.5‑3mm的凹陷。[0097]在其它实施方式中，本发明涉及一种装置，其中热传递表面具有用于去除过量的液体、优选地用于去除过量的接触促进材料的通道。[0098]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其包括按压装置框架，该按压装置框架包括铰链和把手。

[0099]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中热传递表面由选自不锈钢、铜、铝或其混合物的传导材料制成。[0100]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其包括用于储存冷却剂的冷却剂储存器。

[0101]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其包括用于将热传递表面与室温隔热并保护使用者的隔热框架。[0102]在其它实施方式中，本发明涉及一种装置，其包括用于在暴露区域内实现一致性热交换的翅片支撑件。

[0103]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其包括用于提供增加与冷却剂的接触面积的翅片。

[0104]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，包括用于去除在热传递表面和容器之间的残留空气的接触层。

[0105]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中接触层是液体、糊剂、纸或贴纸，优选地其中，接触层的高度为0.1mm‑3mm。[0106]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中容器的长径比高度/宽度大于1。[0107]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中容器壁和容器底部由不同的材料制成。

[0108]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中容器壁由聚合物、陶瓷、玻璃或其它低导热性材料制成。

[0109]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中容器底部由选自不锈钢、铝或其它材料的高传导率材料制成，或者使用诸如聚合物、玻璃或其它材料的低传导性材料构造。[0110]在其它实施方式中，本公开涉及一种装置，其中装置是冷冻装置。[0111]在其它实施方式中，本发明涉及根据本公开冷冻的生物溶液。[0112]详细描述[0113]如上所述，冷冻保存诸如生物材料和溶液的敏感物质的主要之一是与冷冻和解冻现象相关的不一致性。许多变量导致冷冻不一致性，其中两个主要问题与自然对流和冰核形成有关。

[0114]本文公开了一种新的装置和方法，其能够在容器批次中进行单向自下而上的冷冻，并且对于优选小于2ml的小体积具有高再现性。

[0115]还描述了一种在小体积容器批次中实现单向自下向上冷冻的方法，该方法包括以下步骤：将热传递表面预冷却至低温(例如低于‑40℃)；将多个容器设置在支架中，并通过使用中间接触促进材料(例如液体或聚合物)将支架压向热传递表面而使所有容器与冷表

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面同时接触，以实现控制成核；在较小的体积层成核后，将支架和容器设置在与冷表面分开的位置；最终将支架压靠在冷表面上，同时以单向自下而上的几何形状控生长速率。[0116]因此，本文描述了用于实现前述方法的冷冻生物溶液的装置，其中生物溶液是液体生物溶液或悬浮液，该装置包括驱动器，该驱动器以向下的力迫使容器在锁定(lock down)位置接触热传递表面。当容器全部同时压靠在热传递表面上时，成核过程开始，使用中间接触促进材料以确保在成核过程中冻结的液体的分数不高于总体积的20％。然后，为避免液体在成核事件后不受控制地冷冻，将驱动器设置在抬锁(锁打开，lock up)位置，并将容器保持在待用位置，该待用位置通过气隙与热传递表面分开0.1mm至15mm，同时将生物溶液保持接近0℃。最后，为了在受控的冰生长速率下促进单向自下而上的冷冻，再次向下按驱动器以促使容器底部与热传递表面接触，并取决于生物材料的热敏性通过以通常为0.1℃/min至100℃/min冷却热传递表面来施用选定的冷冻速率。

[0117]本文描述的用于实现前述方法的冷冻生物溶液的装置包括以下元件：包括热传递表面(101)的冷冻头(100)，可以包括具有其中容器(109)适合的接收腔的支架(102)，并且还可以包括按压装置(103)。冷冻坛(freezing altar)连接到可以不同配置表示并使用几种冷却剂和或其它已知冷却系统的系统(114)装置。冷冻头加冷却系统的装置可以通过如图3的实例的涉及容器和或隔热件的配置来呈现。

[0118]在不意图本申请目的的图1至9所示的实施方式中，示出了用于通过生物材料的冷冻和/或解冻、储存和运输过程来进行保存的装置。[0119]在一个实施方式中，容器(109)将在生物样品的冷冻、解冻、储存和运输期间保持该生物样品。它们是使用生物安全材料专门制造的，以在所有过程中保持样品安全。容器(109)相应地设计成适合支架(102)空腔、不同体积的样品和所需的不同热处理。容器(109)的规格要考虑到热交换的具体整个过程。容器(109)可具有5mm至50mm的高度和4mm至10mm的直径，长径比(高度/宽度)大于1。容器壁(122)可具有0.4mm至2mm的厚度，并且容器底部(123)的厚度可以在0.2mm至2mm变化。[0120]在一个实施方式中，为了保持本文提出的单向冷冻过程，容器壁(122)和容器底部(123)可以由不同的材料制成。容器壁(122)可以由聚合物、陶瓷、玻璃或其它低导热材料构造，以在容器(109)的侧表面上保持低传导率。容器底部(123)可以使用高传导率材料例如不锈钢、铝或其它材料来构造，或者使用低传导性材料例如聚合物、玻璃或其它材料来构造。取决于为所采用的特定热交换方法计算出的热动力，容器(109)的底部可以具有低或高传递系数。材料的差别可以容易获得垂直驱动的热通量梯度，而不受到容器壁(122)的显著影响，特别是在冷冻小体积样品时，因为与样品体积相比，来自容器(109)的质量比是显著的。

[0121]在一个实施方式中，冷却系统(114)由冷冻头(100)和允许控制热传递表面(101)和容器(109)上的温度的其它元件表示。集成部件可以是任何电子设备，其机械或加工用于产生通过冷却系统(114)的受控驱动热通量。在图4中示出了冷却系统设置的实例。翅片(115)将在冷却剂之间传递热量，冷却剂可以是干冰、液氮或其它。冷却剂储存在冷却剂储存器(113)上。翅片支撑件(112)直接附接到翅片(115)，并且当容器(109)和支架(102)与热传递表面(101)接触时，将有助于避免温度波动。当容器(109)接触热传递表面(101)时，来自热传递表面(101)的惯性将使容器(109)内部的一小层样品(小于总体积的20％)冻结，同

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时热传递表面(101)也在热交换过程中升高温度。由于在容器(109)上形成第一冰层的过程中，来自热传递表面(101)的温度上升至较高的温度，因此冰生长将会变慢并且由翅片支撑件(112)温度控制。

[0122]在一个实施方式中，始终包括水平板(所谓的热传递表面(101))的冷冻头(100)以特定的配置构建，以容纳包含生物溶液的容器(109)或将容器(109)引入其中的支架(102)。冷冻头(100)以及相应包括的部件和实施方式设计成具有特定特征，以控制来自冷却系统(114)的热传递通量，该热传递通量通过热传递表面(101)，最终到达容器底部(123)。如图1和图2所示，增加从热传递表面(101)直到容器(109)的热传递的一种可能的配置是由于存在按压装置(103)，其会迫使容器(109)紧密固定至热传递表面(101)，几乎关闭这些之间的所有气隙。

[0123]在一个实施方式中，热传递表面(101)由诸如不锈钢、铜、铝或其它材料的传导材料制成，并且尺寸可以变化，因此它可以容纳一个容器(109)、几个，或支架(102)也可以具有不同大小。热传递表面(101)的大小应使上表面可具有1cm2至150cm2，取决于接收物品的类型和数量。热传递表面(101)的厚度可为1mm直至4mm。在实施方式中，热传递表面(101)以矩形形状表示，但是取决于装置的设计，它也可以采取任何其它形状。然而，特定配置中的热传递表面(101)的尺寸要考虑到整个装置的特性，允许具有公知的整体热导率和惯性。热传递表面(101)可通过螺钉、任何类型的胶或糊剂附接到冷却系统(114)。也可以通过其它锁定装置进行引导或压缩。[0124]在一个实施方式中，为了去除热传递表面(101)与容器(109)或支架(102)之间的残留空气，可以使用流体、糊剂、纸、贴纸或去除两者之间的气隙的其它方式。该特征增加热传递并使其统一。在贴纸或糊剂的情况下，也可以将其作为接触层(119)添加到容器(109)或支架(102)中。距该接触层的高度可以为0.1mm至3mm。而且，在非固体接触层的情况下，可以固定高度，并且容器(109)或支架(102)可以在仍然浸渍的同时更靠近或更远离热传递表面(101)移动，允许这种方式改变过程中热通量的范围。

[0125]本文给出了热传递表面(101)配置的设计的两个非性实例；平坦配置(101a)或凹槽配置(101b)。这里描述的凹槽版本(101b)可以包括通道(116)和热传递表面的凹槽(117)，其目的是在热传递表面(101)和容器(109)之间保持特定的流体高度。热传递表面的凹槽(117)具有所使用的流体最终保留的特定高度层。如果使用者过度填充热传递表面的凹槽(117)，则过量的流体将通过通道(116)溢出，从而保持期望的流体高度。热传递表面的凹槽(117)的凹陷可具有0.5mm至3mm的凹陷深度。通道(116)将从热传递表面的凹槽(117)中排出多余的流体，并将流体引导至热传递表面(101)的外侧的排污口(sinkhole)中，然后过量的流体可通过装置上的其它排污口导向件行进。通道(116)可具有0.5mm直至3mm的深度，以及1mm直至5mm的宽度。[0126]在一个实施方式中，支架(102)设计成接收容器(109)，并且可以具有不同的空腔设计和尺寸，这取决于接收的容器(109)的类型。而且，对于所接收的容器(109)的数量和将使用该容器的热传递表面(101)的配置，配置可能有所不同。用于构造支架(102)的材料可以是塑料、陶瓷、复合材料或具有低热导率的其它材料以使容器(109)的侧面和顶部隔热。支架(102)也可以具有来自具有多种功能的任何其它材料的实施方式。[0127]在图6、图7和图8中示出了支架102的三个实例。这些实例示出了控制将容器(109)

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压靠在热传递表面(101)上的精确时间的可能性。这些设计成与按压装置(103)致动系统一起使用以将容器(109)压靠在热传递表面(101)上。在这些非性实例中，使用接触层(119)的实施方式去除空气，在其它情况下，这可以通过施加在支架(102)或热传递表面(101)上的接触促进材料(例如液体或其它)代替。当将接触层(119)直接添加到支架(102)时，其可以由任何贴纸制成或胶合在特氟龙、聚合物或其它的层中。该层的厚度可以为0.1mm直至2mm。然而，对于一般的热流装置，必须考虑由此增加的额外的耐热性。[0128]在一个实施方式中，具有弹簧配置的支架(102a)将通过来自弹簧(118)的机械阻力将容器(109)保持在准备开始抬锁(图2)位置。当按压装置(103)用足以超过弹簧弹力的向下力推动容器(109)时，这些将在锁定(图1)位置与热传递表面(101)接触，并且热过程将开始。当处于抬锁(图2)位置时，可压缩支架(102)与热传递表面(101)具有可以为0.1mm直至10mm的距离，当处于锁定(图1)位置时，该距离几乎为0mm。该配置包括弹簧(118)，其可以是从支架(102)本身的延伸件，或者是由金属、聚合物或其它材料制成的附加实施方式。弹簧(118)的直径可以从3mm直至10mm不等，并且可以多种配置和数量设置。弹簧(118)从支架(102)离开底表面移动的延伸量可以从0.1mm直至10mm变化，并且将控制从支架(102)到热传递表面(101)的初始距离。[0129]在一个实施方式中，具有凸片配置(102b)的支架将通过来自凸片(120)的机械阻力将容器(109)保持在准备开始抬锁(图2)位置。当按压装置(103)用足以超过凸片弹力或破坏凸片的向下力推动容器(109)时，这些将在锁定(图1)位置与热传递表面(101)接触，并且热过程将开始。处于抬锁(图2)位置时的支架(102)与热传递表面(101)具有可从0.1mm直至10mm的距离，当处于锁定位置(图1)时，该距离几乎为0mm。该配置包括凸片(120)，其可以是从支架(102)本身的延伸件，或者可以是由金属、聚合物或其它材料制成的附加实施方式。凸片(120)的宽度可以从2mm直至10mm不等，且长度可以为4mm至15mm，凸片(120)可以几种配置和数量设置。凸片(120)从支架(102)离开底表面移动的延伸量可以从0.1mm直至10mm变化，并且将控制从支架(102)到热传递表面(101)的初始距离。[0130]在一个实施方式中，具有销配置的支架(102c)，当处于抬锁(图2)位置时，支架(102)和接触层(119)接触热传递表面(101)。当处于锁定(图1)位置时，按压装置(103)将在容器(109)上产生的向下力，其超过来自销(121)的机械阻力，在该过程期间使这些销断裂或弯曲。销可以任何数量或配置设置在支架(102)的内腔内，并且可以是支架的部分，也可以是任何聚合物、金属或其它材料的附加实施方式，其可以通过将它保持在待用位置的任何其它方法胶合、包覆或附加。如果销(121)是可断裂的，则其可以是一次性的，或者如果是柔性的，则可以多次使用。取决于配置，从容器(109)底部到接触层(119)或热传递表面(101)的距离可以是0.1mm直至10mm的距离。[0131]在一个实施方式中，取决于配置，按压装置(103)将机械致动以将容器(109)压到热传递表面(101)或接触层(119)。驱动器具有在图1和图2中示出的两个位置，分别为锁定和抬锁。当将按压装置(103)设置在抬锁位置(图2)时，容器(109)通过气隙保持在与冷的热传递表面(101)分开的待用位置，分开距离可以在0.1mm至10mm变化。当驱动器处于锁定(图1)位置时，几乎消除存在的气隙。这可以通过接触层(119)或存留在容器(109)与热传递表面(101)之间的任何流体、糊剂、贴纸或其它实现。在图1和图2中，仅示出了用于按压装置(103)致动的手动配置的实例。按压装置(103)也可以由电子控制的机械致动器来操作。在

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图1和图2的实例上，压缩机(108)是抵靠容器(109)的放置区域的较重部件，其允许所有容器(109)达到均匀分布的压力区。在该实例中，压缩机(108)由枢轴(107)支撑，该枢轴(107)允许压缩机(108)沿着所有容器(109)调节，同时按压装置(103)移动到锁定位置(图1)。枢轴(107)位置以及来自按压装置框架(104)的设计一起，迫使压缩机(108)在来自机构的下压力期间保持在水平位置。按压装置框架(104)加上枢轴(107)的这种配置具有机械限位器(stops)，即使并非所有空腔都填充容器(109)，其也允许在离开支架(102)位置上的正常使用。还示出了铰链(106)和把手(105)作为该机构的可能配置。

[0132]本公开的另一方面涉及一种使用前述装置冷冻生物溶液的方法，包括以下步骤：[0133]将热传递表面(101)预冷却至低温(例如低于‑40℃)；[0134]将至少一个容器(109)放置在支架(102)中，并通过在锁定位置上的按压装置(103)通过按压支架(102)使所有容器底部(123)同时与热传递表面(101)接触，以实现受控的成核；

[0135]在较小的体积层(≤总体积的20％)成核后，将按压装置(103)设置在抬锁位置，且支架(102)通过气隙保持在与热传递表面(101)分开0.1mm直至15mm的待用位置，同时将生物溶液保持在接近0℃，以避免成核后液体部分不受控制地冷冻；[0136]将按压装置(103)设置为锁定位置，将支架(102)压靠在热传递表面(101)，促使容器底部(123)与冷的热传递表面(101)接触；[0137]将装置设定为受控的冷冻速率，促使单向自下而上的冷冻几何形状。

[0138]本公开的重要方面是在容器底部(123)和热传递表面(101)之间获得良好的接触，以促使在所有容器中受控且一致的成核。因此，作为引起成核的冷源，可以使用具有平坦配置(101a)或凹槽配置(101b)的热传递表面。凹槽配置(101b)将改善热传递表面(101)与容器(109)之间的热传递，因为它可以填充特定高度的前述接触促进材料(例如液体或聚合物)。该凹槽配置(101b)将允许所有容器具有与接触促进材料相同的高度，而与所用容器的数量无关。

[0139]下面关于在冷冻过程期间使用或不使用接触促进材料的不同水溶液的成核时间，详细讨论其它实例。

[0140]在一个实施方式中，将装有6mm高度的液体的几个容器放置在前述支架(102)中，并通过按压装置(103)将其压靠在热传递表面(101)。对于该实验测定，使用了两种不同的水溶液，即10％的海藻糖溶液(图10)和10％的DMSO溶液(图11)。

[0141]图10和11示出了在具有6mm高度的液体的容器内两种水溶液的成核时间的典型范围。如在图10中可以看出的，当在成核过程中使用接触促进材料时，所有样品在1至20秒的范围内成核，而如果不使用接触促进材料，则该范围增加到26至67秒。当观察海藻糖溶液的成核时(图10)，使用接触促进材料在5秒(5到10秒)范围内有66％的样品成核，而没有接触促进材料的成核时间分布较宽，在25秒(32至57秒)的范围内。在10％的DMSO溶液的成核中

其中可以看出，使用接触促进材料，成核更快地(5‑20秒)且在观察到了类似的结果(图11)，

更短的时间范围内发生。[0142]在一个实施方式中，本发明的方法和装置不仅用于冷冻，而且用于解冻生物样品。[0143]因此，当与由于使用具有平坦配置的热传递表面且没有接触促进材料而产生的宽范围的成核时间相比时，具有特定高度的接触促进材料的凹槽配置提供了更大程度的成核

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控制，其很可能影响冷冻溶液的其它性能方面和特性。

[0144]本公开的另一个重要方面是将成核与控制速率冷冻分离。为此目的，必须确保在成核步骤中，冻结的液体分数应不高于20％，优选不高于10％，然后将剩余的液体部分以受控的速率冷冻。因此，在小部分的溶液成核之后，必须从热传递表面撤回样品，使得溶液不会继续不受控制地冷冻。因此，在成核所需的时间之后，样品与热传递表面略微间隔开，使得预成核的溶液部分保持冻结状态，而液体部分保持在约0℃。最后，所有样品都具有部分溶液冻结而剩余液体处于相同温度(0℃)，然后这些可以通过施加受控的冷冻速率以单向自下而上方式冷冻。

[0145]每当在本文献中使用时，术语“包括”旨在表示存在所述特征、整数、步骤、组件，但不排除存在或增加一个或多个其它特征、整数、步骤、组件或其组。[0146]本领域技术人员将理解，除非本文另外指出，否则所描述的步骤的特定顺序仅是说明性的，并且在不脱离本公开的情况下可以改变。因此，除非另有说明，否则所描述的步

意味着在可能的情况下，可以任何方便或可取的顺序执行这些步骤。骤因此是无序的，

[0147]不应以任何方式将本公开局限于所描述的实施方式，并且本领域技术人员将预见到对其修改的许多可能性。

[0148]上述实施方式是可组合的。所述权利要求进一步阐述本公开的特定实施方式。[0149]参考文献

[0150][1]Rodrigues MA，Balzan G，Rosa M，Gomes D，de Azevedo EG，Singh SK，et al.The importance of heat flow direction for reproducible and homogeneous freezing of bulk protein solutions.Biotechnol Prog 2013；29：1212‑21.doi：10.1002/btpr.1771.[0151][2]Rosa M，Tiago JM，Singh SK，Geraldes V，Rodrigues MA.Improving Heat Transfer at the Bottom of Vials for Consistent Freeze Drying with Unidirectional Structured Ice.AAPS PharmSciTech 2016；17：1049‑59.doi：10.1208/s12249‑015‑0437‑3.

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