重庆医科大学学报２０１０年第３５卷第７期（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０１０ Ｖｏ１．３５ Ｎｏ．７） 一９９９一 基础研究文章编号：０２５３—３６２６（２０１０）０７—０９９９—０５ 内毒素诱导巨噬细胞ＨＭＧＢ１表达的实验研究 冯华国－，孙航ｚ，吴传新 ，郭 晖ｚ，龚建平－，刘 杞ｚ，李生伟 ４０００１０） （１．重庆医科大学附属第二医院肝胆外科；２．重庆医科大学病毒性肝炎研究所，重庆【摘要】目的：探讨内毒素（脂多糖，Ｌｉｐ叩ｌｙｓａｃｃｈａｒｊｄｅ，ＬＰＳ）刺激巨噬细胞后高迁移率族蛋白Ｂ１（Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ１， ＨＭＧＢ１）的释放和表达水平。方法：用１００ ｎｇ／ｉｎｌ的ＬＰＳ刺激ＲＡＷ２６４．７细胞，分别于刺激后０、６、１２、１８、２４、３０、３６ ｈ和４８ ｈ，用 Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ检测细胞培养上清、细胞浆和细胞核内ＨＭＧＢ１蛋白的含量；用ＲＴ—ＰＣＲ检测细胞中ＨＭＧＢ１的ｍＲＮＡ表达情况； 用免疫细胞化学、激光共聚焦显微镜观察ＬＰＳ刺激后细胞浆和胞核内ＨＭＧＢ１的含量变化。分别于ＬＰＳ刺激后０、１、２、４ ｈ和６ ｈ，用酶联免疫吸附实验（Ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）测定细胞培养上清中ＴＮＦ—ｏｔ、ＩＬ一６的含量。结果：ＬＰＳ刺激后０～ １２ ｈ细胞培养上清中无法检测到ＨＭＧＢ１蛋白，１８ ｈ后细胞培养上清中ＨＭＧＢ１蛋白的含量开始增加，于２４ ｈ达到高峰，以后 稳定维持在较高水平；ＬＰＳ刺激前，ＨＭＧＢ１主要分布于细胞核内，胞核中ＨＭＧＢＩ蛋白含量较高，胞浆中ＨＭＧＢ１蛋白含量少； ＬＰＳ刺激后１２～４８ ｈ细胞浆中ＨＭＧＢＩ蛋白含量逐渐增加；而ＬＰＳ刺激后１２～２４ ｈ细胞核内ＨＭＧＢ１含量逐渐减少，３０ ｈ后细 胞核内ＨＭＧＢ１含量又逐渐增多。ＲＴ—ＰＣＲ结果显示，ＬＰＳ刺激后０～１８ ｈ，培养细胞中ＨＭＧＢ１的ｍＲＮＡ表达量无明显变化， ２４ ３６ ｈ培养细胞中ＨＭＧＢ１的ｍＲＮＡ表达量明显增加。ＥＬＩＳＡ结果显示，ＬＰＳ刺激后１ ｈ，细胞培养上清中ＴＮＦ一 、ＩＬ一６的含 量明显增高，２ ｈ达到高峰。结论：Ｉ Ｐｓ可诱导单核一巨噬细胞内ＨＭＧＢ１、ＴＮＦ—ｏｔ、ＩＬ一６表达和释放增加，ＬＰＳ诱导巨噬细胞释 放ＨＭＧＢ１的时间明显晚于ＴＮＦ—ｏｔ、ＩＬ一６的释放时间；ＬＰＳ诱导巨噬细胞内的ＨＭＧＢ１从细胞核向细胞浆转位，并释放到细胞 外；ＬＰＳ诱导巨噬细胞ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ基因表达上调的时间和蛋白合成的时间出现较晚。 【关键词】高迁移率族蛋白Ｂ１；脓毒症；内毒素 【中国图书分类法分类号】Ｒ６３１ ＿２ 【文献标识码】Ａ 【收稿日期】２００９—０８—３１ Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＨＭＧＢ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＬＰＳ ＦＥＮＧ Ｈｕａ－ｇｕｏ，ｅｔ ａｌｌ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＨｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｓｕｒｇｅｒｙ， Ｓｅｃｏｎｄ Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ １（ＨＭＧＢ １）ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｌｉｐｏｐｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（Ｉ ＰＳ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ—ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＲＡＷ２６４．７ ｗａｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＬＰＳ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ＨＭＧＢ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ，ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＭＧＢ １ ｍＲＮＡ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅ ＨＭＧＢ １ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｎｄ ｎｕｃｅｌｕｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｅｙｔｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｌａｓｅｒ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＬＣＳＭ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ＨＭＧＢ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ０～１２ ｈ，ｂｕｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｆｒｏｍ １ ８ｈ，ｒｅａｃｈｅｄ ａ ｐｅａｋ ａｔ ２４ ｈ ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｓｔａｂｌｙ ａｔ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＰＳ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＨＭＧＢ １ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｒｏｍ ０ ｈ ｔｆｏ ４８ ｈ．Ｔｈｅ ＨＭＧＢ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｎｕｃｌｅｕｓ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ａｔ ０ ｈ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ａｔ １２～２４ ｈ，ｈｕｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ａｔ ３６～４８ｈ ａｆｔｅｒ ＬＰＳ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｉｃａｎｔｆｌｙ ｃｈａｎｇｅｄ ａｔ ０～１ ８ ｈ ｂｕｔ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｔ ２４～３６ ｈ ａｆｔｅｒ ＬＰＳ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ＨＭＧＢ １．ＴＮＦ—ｏｔ ａｎｄ ＩＬ一６ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＬＰＳ．ＨＭＧＢ １ ｗａｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｌａｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ＴＮＦ－ｏｔ ａｎｄ ＩＬ－６．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＭＧＢ １ ｍＲＮＡ ｉｓ ｄｅｌａｙｅｄ． ＨＭＧＢ Ｉ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｔｏ ｏｕｔｓｉｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｃｏｍｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｒｉｏｒ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｔ ｅａｒｌｙ ｔｉｍｅ．Ｌａｔｅｌｙ ｎｅｗ ＨＭＧＢ １ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ，ｗｈｉｃｈ ｌｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＨＭＧＢ １ ｉｎ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ １；Ｓｅｐｓｉｓ；ＬＰＳ 脓毒症是由细菌感染引起的一种致死性、全身性炎症反 作者介绍：冯华国（１９８２一），男，硕士， 研究方向：外科感染与信号转导。 通讯作者：吴传新，男，副教授，Ｅ—ｍａｉｈｗｕｃｈｕａｎｘｉｎ＠ｍｅｄｍａｉｌ．ＣＯｉｌ３．ｃｎ 基金资助：重庆市卫生局中医药科技项目（编号：２００９—２—１４８）；重庆 应，是临床危重患者主要的死亡原因之一Ⅲ。脓毒症发生发展 的根本原因在于机体过度释放细胞因子和炎性介质，导致炎 症反应失控和免疫功能紊乱。因此，细胞因子和炎性介质在 脓毒症的发生发展中起十分重要的作用。近年来发现，高迁 移率族蛋白Ｂ１（Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＩ，ＨＭＧＢ１）是一 市科委自然科学基金（编号：ＣＳＴＣ，２００８ＢＢ５２２８） 重庆医科大学学报２０１０年第３５卷第７期（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０１０．Ｖｏ１．３５ Ｎｏ．７】 种重要的脓毒症“晚期炎性介质”，其出现时间晚，维持时间 长，在脓毒症的延迟性致死效应中发挥十分重要的作用，因 此可作为脓毒症防治研究中的一个潜在的分子靶点＿２．，１。然 而，尽管目前对ＨＭＧＢ１在脓毒症所致的多器官功能衰竭中 的作用有了较多的认识和肯定，但脓毒症时ＨＭＧＢ１释放 的规律尚未完全阐明。本研究拟采用ＬＰＳ刺激巨噬细胞，观 察ＬＰＳ刺激后ＨＭＧＢ１表达和释放的情况，试图阐明脓毒症 ＨＭＧＢ１表达和释放的规律，为临床治疗脓毒症提供实验依 据。 １材料和方法 １．１实验材料 １．１．１细胞株小鼠腹腔巨噬细胞株ＲＡＷ２６４．７，购于中国 科学院上海细胞研究所，由重庆医科大学附属第二医院外科 实验室保存。 １．１．２主要试剂ＨＭＣＢ１抗体（兔多克隆抗体）购自ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司；脂多糖ＬＰＳ（Ｅｓｃｈｅ ０ ｃｏｌｉ，Ｏ１１１：Ｂ４）购自 美国Ｓｉｇｍａ公司；ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＲＮＡ抽提）购自上海飞捷 生物技术有限公司；ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０购自 宝生物（大连）工程有限公司；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提 试剂盒、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ及ＩＰ细胞裂解液购自碧云天生物技术 研究所；ＴＮＦ一０【ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、ＩＬ一６ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ购自晶美生物工 程有限公司；ＦＩＴＣ标记的羊抗兔ＩｇＧ、ＦＩＴＣ标记羊抗小鼠 ＩｇＧ、辣根过氧化物酶标记羊抗兔ＩｇＧ、辣根过氧化物酶标记 羊抗小鼠ＩｇＧ购自北京中杉金桥生物技术有限公司；抗 Ｂ—ａｅｔｉｎ小鼠单抗购自武汉博士德生物工程有限公司； ＴＮＦ一 ＥＬＩＳＡ试剂盒购自晶美生物工程有限公司；ＩＬ一６ ＥＬＩＳＡ试剂盒购自晶美生物工程有限公司。 １．２实验方法 １，２．１ 细胞培养及处理将对数生长期的ＲＡＷ２６４．７细胞 消化后，接种于培养瓶，用无血清的ＲＰＭＩ１６４０培养液在 ３７％，５％ＣＯ 孵箱内培养１２ ｈ，加入含１００ ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ的ＲＰ— ＭＩ１６４０培养液培养０、６、１２、１８、２４、３０、３６、４２ ｈ和４８ ｈ，用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测培养液中ＨＭＧＢ１蛋白含量；提取细胞总 ＲＮＡ，用ＲＴ—ＰＣＲ检测培养细胞ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ水平；提取 培养细胞胞核蛋白和胞浆蛋白，用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测细胞核 和细胞浆ＨＭＧＢ１蛋白含量；用细胞免疫化学、共聚焦显微 镜观察细胞内ＨＭＧＢ１蛋白的表达和细胞内分布；加入含 １００ ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ的ＲＰＭＩ１６４０培养液培养０、１、２、４ ｈ和６ ｈ，按 ＥＬＩＳＡ检测试剂盒说明书测量细胞培养液中ＴＮＦ— 、ＩＬ一６ 的含量。 １．２．２ Ｗｅｓｔｅｒｎ蛋白印迹分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）采用ＢＩＯ—ＲＡＤ 垂直板电泳槽、转移电泳芯、电泳仪，按说明步骤进行。将处 理好的样品加入电泳槽，每孔ｌ５ ｍｌ，１２％的聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离，电转至ＰＶＤＦ膜，在５％牛血清白蛋白的ＴＢＳ缓冲 液中封闭１ ｈ，加入兔抗ＨＭＧＢ１多克隆抗体（１：２５０），于 ３７０Ｃ摇床上平缓摇动２ ｈ，加入以１：ｌ ０００的ＨＲＰ标记的羊 抗兔ＩｇＧ，于３７℃摇床上平缓摇动２ ｈ，ＤＡＢ（新鲜配制）显 色约５ ａｒｉｎ，自来水终止后成像仪中曝光，存像。利用ＧＥＮＥ ＧＮＯＭＥ凝胶成像分析系统进行成像和图形分析，测出各条 带的光密度值，对目的蛋白条带进行密度分析，结果以 ＨＭＧＢ１条带的光密度值（ＲＯＤ）×面积（ｍｍ ）表示，然后进行 统计分析。 １．２．３逆转录一多聚酶链聚合物反应（ＲＴ—ＰＣＲ）按ＦＡＳＴ ＧＥＮ—ＲＮＡ ｆａｓｔ２００（上海飞捷生物技术有限公司）总ＲＮＡ提 取的说明步骤提取总ＲＮＡ。根据参考文献【４】由Ｐｆｉｍｉｅｒ４．１软 件设计小鼠ＨＭＧＢ１和内参照Ｂ—ａｅｔｉｎ引物，由上海生工生 物工程技术有限公司合成。小鼠ＨＭＧＢ１引物：上游引物：５’ 一ＣＣＧ ＡＡＴ ＴＣＧ Ｃ下Ｔ ＣＴＧ ＴＣＡ ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＡＧ ＡＧＴ ｒｒｒ ＣＣ 一３’；下游引物：５’一ＧＣＧＴＡＡＴＡＣ ＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＧＣ ＣＴＣ ＴｒＧ ＧＧＴ ＧＣＡ ＴｒＧ一３’； 扩增产物大小为２１０ ｂｐ左右。小鼠￥一ａｃｔｉｎ引物：上游引物： ５’一ＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＴＧＡＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴ一３’；下游弓ｌ 物：５’一ＣＣＴ ＡＧＡ ＡＧＣ ＡＴｒ ＴＧＣ ＧＧＴ ＧＣＡ ＣＧＡ ＴＧ一３’；扩 增产物大小为２８４ ｂｐ左右。 ＲＴ—ＰＣＲ扩增：参照试剂盒操作说明书进行。逆转录反 应体系ｌ０ １，逆转录反应条件：３０％１０ ｍｉｎ、５０ｏＣ３０ ｍｉｎ、 ９９％５ ｍｉｎ、５℃５ ａｒｉｎ；ＰＣＲ扩增反应体系５０ ｌ，ＰＣＲ扩增反 应条件：９４￣Ｃ ＡＭＶ ＲＴ灭活和ＲＮＡ／ｃＤＮＡ／引物变性２ ａｒｉｎ、 ９４℃变性３０ ｓ、６Ｏ℃退火３０ ｓ、７２℃延伸２０ ｓ、３５个ｃｙｃｌｅｓ； ７２℃延伸７ ｒａｉｎ、４℃ｓｏａｋ。反应结束后，取ＰＣＲ扩增产物５ ｍｌ，在１．５％的琼脂糖凝胶上点样，９０ Ｖ电压电泳２０ ｍｉｎ，紫外 灯下观察结果。利用凝胶成像分析系统进行紫外光成像和图 形分析，测出各条带的光密度值，结果以ＨＭＧＢ１条带的光 密度值／Ｂ—ａｅｔｉｎ条带的光密度值表示。 １．２．４细胞核蛋白与细胞浆蛋白提取按试剂盒说明书进 行。具体步骤如下：收集细胞沉淀，每２０ ｍｌ细胞沉淀中加入 ２００ ｍｌ添加了ＰＭＳＦ的细胞浆蛋白抽提试剂Ａ，最高速剧烈 Ｖｏ￣ｅｘ ５ ｓ，冰浴１０～１５ ｍｉｎ；加入细胞浆蛋白抽提试剂Ｂ １０ ｍｌ，最高速剧烈Ｖｏ￣ｅｘ ５ ｓ，冰浴１ ｍｉｎ，最高速剧烈Ｖｏ￣ｅｘ ５ ｓ， ４℃、１２ ０００～１６ ０００ ｇ离心５ ｍｉｎ，立即吸取上清至一预冷的塑 料管中，即为细胞浆蛋白；于沉淀中加入５０ｍｌ添加了ＰＭＳＦ 的细胞核蛋白抽提试剂，最高速剧烈Ｖｏ￣ｅｘ １５—３０ ｓ，放回冰 浴中，每隔１～２ ｍｉｎ再高速剧烈Ｖｏ￣ｅｘ １５～３０ ｓ，共３０ ａｒｉｎ， ４℃、１２ ０００～１６ ０００ ｇ离心１０ ｍｉｎ，立即吸取上清至一预冷的 塑料管中，即为细胞核蛋白。 １．２．５细胞免疫化学、共聚焦显微镜观察将对数生长期的 ＲＡＷ２６４．７细胞在载有血盖片的２４孔培养板中（１ Ｘ １０６个／ 孔）中培养１２ ｈ后，加入含１００ ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ的ＲＰＭＩ１６４０培养 液培养０、６、１２、１８、２４、３０、３６、４２ ｈ和４８ ｈ，用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ 漂洗，４％多聚甲醛室温下固定３０ ｍｉｎ，３％Ｈ：０２封闭３０ ｍｉｎ， 加正常封闭血清室温下孵１０ ｍｉｎ，加入兔抗ＨＭＧＢ１多克隆 抗体（１：２５０），置湿盒内４￣Ｃ过夜；加二抗（ＦＩＴＣ标记的二 重庆医科大学学报２０１０年第３５卷第７期（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０１０．Ｖｏ１．３５ Ｎｏ．７） 一１ ００１一 抗），置湿盒内置湿盒内４ 过夜；加５０ ｍｇ／ｍｌ Ｐｌ，室温孵育 ｌ０ ３０ ｍｉｎ；５０％的甘油封片；激光共聚焦显微镜观察，成像。 １．２．６ ＥＬＩＳＡ检测方法盒说明书进行。 显示，ＬＰＳ刺激后０～１２ ｈ，细胞培养液中ＨＭＧＢ１的含量较 低，几乎无法检测出；ＬＰＳ刺激后１８ ｈ开始，细胞培养液中 ＨＭＧＢｌ的含量明显增加，并一直持续到３６ ｈ，与ＬＰＳ刺激后 按双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ检测试剂 ０ １２ ｈ相比，有显著性差异（ ０．０１）（图３，图４）。 所有数据均以 ±ｓ表示。两组间比较 ２．３ ＬＰＳ刺激后ＲＡＷ２６４．７细胞培养液中ＴＮＦ— 、ＩＬ一６的 水平 １．２．７统计学处理用ｔ检验，Ｐ＜０．０５有统计学差异，Ｐ＜０．Ｏ１有显著性差异。所 有数据应用ＳＰＳＳ１２．０统计软件进行数据分析。 用双抗体夹心法检测细胞培养液中ＴＮＦ— 、ＩＬ一６的含 量，结果显示，细胞培养液中ＴＮＦ—ｄ、ＩＬ一６的含量在ＬＰＳ刺 激后１ ｈ开始增高，２ ｈ达到高峰，与０ ｈ相比，有显著性差异 （Ｐ＜０．０ｌ，图５）。 ２．４ ＬＰＳ刺激后ＲＡＷ２６４．７细胞浆和细胞核内ＨＭＧＢｌ蛋 白含量 ２结果 ２．１ ＬＰＳ刺激后ＲＡＷ２６４．７细胞ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ的表达 用１００ ｎｇ／ｍｌ的ＬＰＳ刺激ＲＡＷ２６４．７细胞，提取每一时 相点细胞总ＲＮＡ，行ＲＴ—ＰＣＲ扩增，１．５％的琼脂糖凝胶电 泳，结果显示：在２１０ ｂｐ左右的位置处有一条明显的ＤＮＡ条 带，与ＨＭＧＢ１的编码基因大小一致；在２８４ ｂｐ左右有一条 明显的ＤＮＡ带，与Ｂ—ａｃｔｉｎ的编码基因大小一致，无非特异 性电泳带。以１３一ａｃｔｉｎ的ＤＮＡ条带作为内参，ＬＰＳ刺激后 ０～１８ ｈ ＲＡＷ２６４．７细胞内ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ基因表达无明显变 化．２４、３０ ｈ和３６ ｈ ＲＡＷ２６４．７细胞内ＨＭＧＢｌ ｍＲＮＡ基因表 达明显增高，与０～１８ ｈ相比，有显著性差异（Ｐ＜０．０１）（图ｌ， 图２）。 用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测细胞核和细胞浆ＨＭＧＢ１蛋白含量， 结果显示，ＬＰＳ刺激后０、６ ｈ，培养细胞胞浆中ＨＭＧＢ１蛋白 含量少，１２～４８ ｈ细胞浆中ＨＭＧＢ１蛋白含量逐渐增加，与０ ｈ相比有显著性差异（Ｐ＜０．Ｏ１ ｏ ＬＰＳ刺激后０ ｈ，胞核中ＨＭＧＢ１ 蛋白含量较高，ｌ２—２４ ｈ细胞核内ＨＭＧＢ１含量逐渐减少， ｌ ｌ ｌ ｌ １ ０ Ｏ ０ Ｏ ８ ６ ４ ２ ０ ８ ６ ４ ２ Ｏ 与０ｈ相比有显著性差异（Ｐ＜０．Ｏ１）；３０—４８ ｈ细胞核内ＨＭＧＢ１ 含量又逐渐增多，与１２～２４ｈ相比有显著性差异（Ｐ＜０．Ｏ１）（图 ６、图７）。 ２．５ ＬＰＳ刺激后ＲＡＷ２６４．７细胞内ＨＭＧＢ１蛋白的分布 ２．２ ＬＰＳ刺激后ＲＡＷ２６４．７细胞培养液中ＨＭＧＢ１蛋白含量 用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测培养液中ＨＭＧＢ１蛋白水平，结果 Ｍａｒｋｅｒ ０ ６ ８ ｌ２ ｌ８ ２４ ３Ｏ 细胞免疫化学、共聚焦显微镜观察结果显示，ＬＰＳ刺激后 ０ ｈ，细胞浆呈弱的绿色荧光染色，６ ｈ后细胞浆中荧光染色开 ３６（ｈ） ６００ ｂｐ ５００ ｂｐ ４００ ｂｎ ３００ ｂｐ ２００ ｂｐ １００ ｂｐ 图１ １ ００ ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ刺激后ＲＡＷ２６４．７ 细胞ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ的表达 ０ ｌ８ ２４ ３０ ３６ 时间（ｈ） 与０ ｈ相比：Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ 图２ １００ ｎｇ，ｍＩ ＬＰＳ刺激后ＲＡＷ２６４．７细 胞ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ的表达 ＨＭＧＢ１ Ｏ．９ 图３ １００ ｎｇ／ｍＩ ＬＰＳ刺激后ＲＡＷ２６４．７细胞培 养液ＨＭＧＢ１蛋白水平 ８００ ７００ ６００ ５００ ４００ ３００ ２００ ｌ００ ０ 一。 ＴＮＦ—ｄ ＩＬ一６ ０．８ Ｏ．７ Ｏ．６ ０．５ Ｏ．４ ０＿３ ０－２ ０．１ ０ ０ １８ ２４ ３Ｏ ３６ 与０ ｈ相比，Ｐ＜０．０ｌ 图４ １Ｏ０ ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ刺激后ＲＡＷ２６４．７细胞培 养液ＨＭＧＢ１蛋白水平 ０ 、ｌ ２ ４ ６ ‘与０ ｈ相比：Ｐ＜Ｏ．０１ 图５ １Ｏ０ ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ刺激后ＲＡＷ２６４．７细胞培养液中 ＴＮＦ—ａ、ＩＬ一６的含量（ｐｇ／ｍ１） 一１ ００２一 重庆医科大学学报２０１０年第３５卷第７期（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０１０．Ｖｏ１．３５ Ｎｏ．７ ＨＭ（ Ｂ１ Ｂ—ａｃｔｉｎ ＨＭＧＢｌ Ｊ 一 刚 ０ １２ ２４ ３６ ４８ ｎｕｃｌｅａｒ 时间（ｈ） 图６ １００ ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ刺激后ＲＡＷ２６４．７细胞胞浆和胞核内 ＨＭＧＢ１蛋白水平 与０ ｈ相比，Ｐ＜０．０１； 与０ ｈ相比，Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ 图７ １ ０Ｏ ｎｇ／ｍＩ ＬＰＳ刺激后ＲＡＷ２６４．７细胞胞浆和 胞核内ＨＭＧＢ１蛋白的表达 厂—— ——＿ｊ Ｉ『 孝 ｊ簪 １ Ａ ９ｌ ０ Ｏ ０ ０ Ｏ Ｏ ０ Ｏ０ Ｏ ８ ７ ６ ５ ４ ３ ２ Ｉ Ｂ 一 Ｄ Ｅ ｝・—■ ■— —］。 Ｉ ｌ 。｜ ｒ－ ｝ 枣 。 ＩＩ 一ｉ．Ｉ Ｉ 。 姆 ： ．Ｉｌ 璺 Ａ．１００．ｇ／ｒ￣ＬＰＳ刺激后０ ｈ；Ｂ．１００ｎｇ／ｎ￣ＬＰＳ刺激后１２ ｈ；Ｃ．１００ｎ￣Ｊｍ］ＬＰＳ劂擞后２４ｈ；Ｄ．１００ ｎ￣＇ｍｌ ＬＰＳ刺激后３６ｈ；Ｅ．ｔＯ０ ｎｇ／ｍｌＬＰＳ刺激后４８ ｈ 图８ １ Ｏ０ ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ刺激后ＲＡＷ２６４．７细胞内ＨＭＧＢ１免疫荧光染色 始增强，１２—４８ ｈ培养细胞的细胞浆内呈强的绿色荧光染色。 ＬＰＳ刺激后０ ｈ，荧光染色主要集中在培养细胞的细胞核，细 胞核呈强的绿色荧光染色；６ ｂ后培养细胞的细胞核内荧光染 色逐渐减弱，到２４ ｈ培养细胞的细胞核内呈弱的绿色荧光染 律仍然未完全阐明。 目前关于ＬＰＳ刺激后巨噬细胞内ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ基因表 达有无变化以及如何变化尚有争议。文献报道用ＬＰＳ刺激臣 噬细胞后２４ ｈ以内细胞内ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ基因表达无明显表 色；３０～４８ ｈ细胞核内荧光染色又逐渐增强（图８ ｏ 化 ，而ＬＰＳ刺激２４ ｈ以上细胞内ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ基因表达 情况未见报道。本研究采用ＬＰＳ刺激巨噬细胞，检测细胞内 ３讨论ＨＭＧＢｌｍＲＮＡ的表达水平，结果显示，ＬＰＳ刺激后０～１８ ｈ ＲＡＷ２６４．７细胞内ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ基因表达无明显变化，２４ ｈ ＨＭＧＢ１是近年研究发现的一种重要的脓毒症“晚期炎 性介质”，是脓毒症促炎细胞因子反应网络的中心环节，是 人们长期寻找的危险信号分子。与其他的核蛋白不同， ＨＭＧＢＩ可释放到细胞外，作为细胞因子，发挥着促炎、调节 神经细胞轴突生长、肿瘤转移以及动脉粥样硬化和血管损伤 后再狭窄等多种病理生理效应＿５ｌｑ。近年研究发现，细胞外的 后ＲＡＷ２６４・７细胞内ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ基因表达明显增强。提 示ＬＰＳ刺激后细胞内ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ基因表达上调出现时间 晚，在刺激２４ ｈ以后出现，其具体机制尚需进一步研究。 尽管目前对脓毒症时ＨＭＧＢ１的释放有较多的研究，但 脓毒症时巨噬细胞内ＨＭＧＢ１的含量变化情况尚缺乏深入 的研究。文献报道用ＬＰＳ刺激巨噬细胞，刺激后１２～２４ ｈ细 ＨＭＧＢ１可能作为潜在的“晚期”炎症介质参与脓毒症的发病 过程，并作为脓毒症前炎性细胞因子反应网络的中心环节， 胞浆中ＨＭＧＢ１蛋白含量逐渐增加，细胞核内ＨＭＧＢＩ含量 逐渐减少１７，１１－１３］而ＬＰＳ刺激２４ ｈ以上细胞中ＨＭＧＢ１的变 在脓毒症的发生发展中起着十分重要的作用ｆ７＿ 。尽管目前 对ＨＭＧＢ１在脓毒症发生发展及引起多器官功能衰竭中的作用有了较多的认识和肯定，但脓毒症时ＨＭＧＢ１释放的规化情况罕见报道。本研究采用ＬＰＳ刺激巨噬细胞，检测 ＨＭＧＢ１蛋白的释放和在细胞内含量变化情况，结果显示， ＬＰＳ刺激后１８ ｈ开始，细胞培养液中ＨＭＧＢ１的含量明显增 重庆医科大学学报２０１０年第３５卷第７期（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０１０．Ｖｏ１．３５ Ｎｏ．７） １００３一 加，并一直持续到３６ ｈ。用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和细胞免疫化学检测 ＬＰＳ刺激后细胞浆和细胞核内ＨＭＧＢｌ蛋白的含量变化，结 果显示，刺激前ＨＭＧＢ１蛋白主要分布在细胞核内，胞浆中 含量少，刺激后１２～２４ ｈ细胞浆中ＨＭＧＢ１蛋白含量逐渐增 加，细胞核内ＨＭＧＢ１含量逐渐减少；ＬＰＳ刺激后３０～４８ ｈ 细胞浆中ＨＭＧＢ１蛋白含量维持在较高水平，而细胞核内 ＨＭＧＢ１含量又逐渐增加；核内ＨＭＧＢ１蛋白含量的增加与 ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ基因表达上调一致，表明ＬＰＳ刺激后３０～４８ ｈ巨噬细胞核内有新的ＨＭＧＢ１蛋白合成，新合成的ＨＭＧＢ１ 补充细胞核内减少的ＨＭＧＢ１蛋白，并进一步从细胞核转位 到细胞浆，再释放到细胞外。以上结果表明ＬＰＳ刺激后０～ ２４ ｈ巨噬细胞内ＨＭＧＢ１的释放来自先期合成的储备，ＬＰＳ 刺激后早期细胞核内先期合成的ＨＭＧＢ１逐渐由细胞核转 位到细胞浆，并释放到细胞外，导致ＬＰＳ刺激后０～２４ ｈ细 胞核内ＨＭＧＢ１含量逐渐减少，细胞浆中ＨＭＧＢ１蛋白含量 逐渐增加；２４ ｈ后细胞内ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ基因表达上调，开始 新合成ＨＭＧＢ１蛋白，细胞内出现新合成的ＨＭＧＢ１，以补充 细胞核和细胞浆内因释放到细胞外而减少的ＨＭＧＢ１，引起 胞浆和胞核内ＨＭＧＢ１蛋白含量增加。 本实验检测了ＬＰＳ刺激后巨噬细胞养液中ＴＮＦ－ 、 ＩＬ一６的含量，结果显示，细胞培养液中ＴＮＦ一仅、ＩＬ一６的含量 在ＬＰＳ刺激后１ ｈ开始增高，２ ｈ达到高峰，而ＬＰＳ刺激后细 胞培养液中ＨＭＧＢ１的含量增加出现在刺激后１８ ｈ，表明 ＬＰＳ刺激后ＨＭＧＢ１释放的时间明显晚于ＴＮＦ— 、ＩＬ一６释 放时间，充分证明ＨＭＧＢ１是一种脓毒症“晚期炎ｌ｝生介质”。 参考文献 ［１］Ａｎｇｕｓ Ｄ Ｃ，Ｌｉｎｄｅ－Ｚｗｉｒｂｔｅ Ｗ Ｔ，Ｌｉｄｉｃｋｅｒ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｓｅｐｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ，ｏｕｔｃｏｍｅ，ａｎｄ ａｓ— ｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｓｔｓ ｏｆｃａｒｅ［Ｊ］．ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ，２００１，２９（７）：１３０３－１３１０． ［２］Ｍａｎｔｅｌｌ Ｌ Ｌ，Ｐａｒｒｉｓ Ｗ Ｒ，Ｕｌｌｏａ Ｌ．Ｈｍｇｂ—ｌ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ［Ｊ］．Ｓｈｏｃｋ．２００６，２５（Ｉ）：４—１１． ［３】Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｌｉ Ｗ，Ｗａｎｇ Ｈ．Ｍｏｒｅ ｔｅａ ｆｏｒ ｓｅｐｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ—Ｇｒｅｅｎ ｔｅａ ｍａｙ ｒｅｄｕｃｅ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ １ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ，２００６，６６（３）：６６０—６６３ 【４］ Ｂｅａｔｒｉｚ Ｒ Ｍ，Ｍａｈｅｎｄａｒ Ｏ，Ｊｉａｎｈｕａ １，ｉ，ｅｔ ａ１．ＩＦＮ－ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ Ｂｏｘ １ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｐａｒｔｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ＴＮＦ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ．２００３，１ ７０（７）：３８９０—３８９７． ［５］Ｓａｐｏｊｎｉｋｏｖａ Ｎ，Ｍａｍａｎ Ｊ，Ｍｙｅｒｓ Ｆ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ＨＭＧＢ １ ｌＪ１．Ｂｉｃｏｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２００５， １７２９（１）：５７—６３． ［６］Ｌｉ Ｗ，Ｓａｍａ Ａ Ｅ，Ｗａｎｇ Ｈ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ＨＭＧＢ１ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓ— ｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００６，６（２）：１３０—１３５． ［７］ＷａｎｇＨ Ｃ，ＢｌｏｏｍＯ，ＺｈａｎｇＭＨ，ｅｔ ａ１．ＨＭＧ一１ ａｓ ａｌａｔｅｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９，２８５（５４２５）：２４８—２５１． ［８］Ｗａｎｇ Ｈ，Ｌｉ Ｗ，Ｌｉ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ａ ｐｏｐｕｌａｒ ｈｅｒｂａｌ ｎｕｔｉｒｅｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ａｎｇｅｌｉｃａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ，ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｌｅｔｈａｌ ｅｎｄｏ— ｔｏｘｅｍｉａ ａｎｄ ｓｅｐｓｉｓ［Ｊ］．ＪＮｕｔｒ，２００６，１３６（２）：３６０—３６５ 【９］Ｌｉｎ Ｘ，Ｙａｎｇ Ｈ，Ｓａｋｕｒａｇｉ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ａｌｐｈａ—ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｌｏｃｋ— ａｄｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ １ ｐｒｏｔｅｉｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｕｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｓｅｐｓｉｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００５，２８９（４）：５８３—５９０． ［１０］Ｓｕｎｄｅｎ—Ｃｕｌｌｂｅｒｇ Ｊ，Ｎ０ｒｒｂｙ—Ｔ ｇｌｕｎｄ Ａ，Ｔｒｅｕｔｉｇｅｒ Ｃ Ｊ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ－１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｅｖｅｒｅ ｓｅｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００６，１９（３）：２３１—２３６． ［１ １］Ｆｉｕｚａ Ｃ，Ｂｕｓｔｉｎ Ｍ，Ｔａｌｗａｒ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｆ ｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ａｅｔｉｖ— ｉｔｙ ｏｆ ＨＭＧＢＩ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２００３， １０１（７）：２６５２—２６６０． ［１２］Ｐａｅｈｏｔ Ａ，Ｍｏｎｎｅｒｅｔ Ｇ，Ｖｏｉｒｉｎ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｙ— ｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ ｌＪ１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．，２００５，１ １４（１）：６１—６９． ［１ ３】Ｈａｒｒｉｓ Ｈ Ｅ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｕ．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨＭＧＢ １ ａｓ ａ ｐｒｏ— ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，３４（６）：１５０３—１５１２． （责任编辑：关蕴良）