LPS、TNF—α、IL—1β刺激RAW264.7细胞分泌NO的比较
作者：殷津津 辛文妤
来源：《中国卫生产业》2017年第14期
[摘要] 目的 研究 LPS、TNF-α、IL-1β刺激RAW264.7细胞分泌NO的剂量、时间依赖性关系，为建立炎症细胞模型提供实验依据。方法 以LPS（0.01、0.10、1.00、10.00 μg/mL）、TNF-α（0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL）或IL-1β（0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL）刺激RAW264.7细胞，24 h后收集细胞上清液Greiss法测定NO的含量。以LPS（1 μg/mL）、TNF-α（10 ng/mL）或IL-1β（10 ng/mL）分别刺激RAW264.7细胞6、12、24、48 h，收集细胞上清液Greiss法测定NO的含量。 结果 不同剂量LPS均可显著诱导RAW264.7细胞分泌大量NO，无明显的剂量依赖性，不同剂量TNF-α或IL-1β均可显著诱导RAW264.7细胞分泌NO，且有一定的剂量依赖性，LPS（1 μg/mL）或TNF-α（10 ng/mL）刺激RAW264.7细胞12～48 h时NO的分泌量显著升高，IL-1β（10 ng/mL）刺激6～48 h均可显著诱NO的分泌，均具有一定的剂量依赖性。 结论 0.01～10.00 μg/mL LPS、 0.10～100.00 ng/mL的TNF-α或IL-1β刺激RAW264.7细胞均可成功复制炎症细胞模型。 [关键词] 炎症、RAW264.7细胞、LPS、TNF-α、IL-1β
[中图分类号] R965 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2017）05（b）-0003-04 [Abstract] Objective To research the correlation between the LPS， TNF-α， IL-1β in
stimulating NO secreted by RAW264.7 cell and time dependence and provide experimental basis for the establishment of inflammatory cell model. Methods The LPS（0.01，0.10，1.00，10.00 μg/mL）， TNF-α（0.10，1.00，10.00，100.00 ng/mL） and IL-1β（0.10，1.00，10.00，100.00 ng/mL） were used to stimulate the RAW264.7 cell， after 24h， the NO content was measured by the Greiss method， and the LPS（1 μg/mL），TNF-α（10 ng/mL） or IL-1β（10 ng/mL）were used to stimulate RAW264.7 cell for 6，12，24，48 h， and the NO content was measured by
collecting the cell supernatant Greiss method. Results Different doses of LPS could obviously induce the NO secreted by RAW264.7 cells without obvious dose dependency， and different doses of TNF-αor IL-1βcould cann obviously induce the NO secreted by RAW264.7 cells with a certain dose
dependency， and the NO secretion volume was obviously increased after LPS （1 μg/mL）or TNF-α （10 ng/mL），and IL-1β（10 ng/mL）stimulation for 6～48 h could obviously induce the secretion of NO with a certain dose dependency. Conclusion 0.01～10.00 μg/mL LPS and 0.10～100.00 ng/mL TNF-α or IL-1β in stimulating the RAW264.7 cell can successfully duplicate inflammatory model.
[Key words] Inflammation； RAW264.7 cell； LPS； TNF-α； IL-1β
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炎症是多种疾病的一个重要标志特征，是机体对内外有害刺激因素做出的自我保护性反应。虽然炎症在一定程度上对机体是有利的，但过度或过久的炎症反应往往会加重许多疾病的发展，如自身免疫性疾病、脓毒症、癌症、动脉粥样硬化、糖尿病等[1-2]。巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，在机体炎症反应中发挥重要作用[3]。小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞来源于小鼠腹腔，是可以永生化的巨噬细胞株，能够稳定进行传代培养[4]。
LPS是革兰阴性菌细胞壁的的重要组成成分，是引起炎症的一类重要诱导剂，LPS与其受体结合后通过一系列信号通路如NF-κB信号通路，诱导多种炎症介质的释放[5]。以LPS诱导RAW264.7细胞在一定程度上可以模拟机体的炎症反应，是目前常用的体外炎症细胞模型[6-7]。此外， TNF-α、IL-1β是炎症反应中最常见的炎症因子，TNF-α是机体应激反应中的核心炎症介质，可诱发血管内皮细胞的表型变为炎症型，导致机体代谢和血液动力学改变，促进炎症介质生成，是导致炎性因子“瀑布效应”的“元凶”[8]。IL-1β是一种能够激活多种免疫和炎症细胞的前炎性细胞因子，在感染、炎症、免疫应激等细胞反应中发挥了重要的作用[9]。LPS、TNF-α、IL-1β均可以诱导RAW264.7细胞发生炎症反应，用于抗炎药物的筛选及其作用机制的评价。该文主要观察不同剂量LPS、TNF-α、IL-1β诱导RAW264.7细胞不同时间后NO分泌量的比较，为建立更理想的炎症细胞模型提供参考。 1 材料与方法 1.1 材料
小鼠巨噬细胞RAW264.7由该实验室前期冻存；LPS、TNF-α、IL-1β购自美国sigma公司。胰蛋白酶、胎牛血清购自美国sigma公司；DMEM培养基购自美国Invitrogen公司。 1.2 实验方法
1.2.1细胞培养 小鼠巨噬细胞RAW264.7在37℃、5%CO2、饱合湿度条件下用含10%胎牛血清的D MEM培养液传代培养。
1.2.2 不同剂量LPS、TNF-α、IL-1β诱导RAW264.7细胞分泌NO的比较 取刚刚长成完整单层的RAW264.7细胞一瓶，胰蛋白酶消化后吹打细胞，调整细胞数目至2×105 cell/mL。于96孔细胞培养板中每孔加入100 μL细胞悬液，置于CO2培养箱中继续培养12 h。取出培养板后吸掉原培养液，每孔加入190 μL无血清培养液。6 h后加入10 μL LPS（终浓度为0.01、0.10、1.00、10.00 μg/mL），或10 μL TNF-α（终浓度为0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL）或10 μL IL-1β（终浓度为0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL），另设正常对照组。然后于微孔板振荡器上振荡混匀，置于CO2培养箱中分别继续培养24 h。收集培养上清液，Greiss测定NO的含量。
取细胞上清液100 μL加入到96孔板中，加入100 μL Griess试剂（0.2%萘基乙二胺和含2%磺胺的0.5%磷酸按1：1比例混合），于微孔板振荡器上振荡使之混匀，室温避光静置10
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min，用酶标仪于540 nm波长处测定吸光度值。计算NO分泌率=（样品孔OD-空白孔OD）/（对照孔OD-空白孔OD）×100%。
1.2.3 LPS、TNF-α、IL-1β诱导RAW264.7细胞不同时间分泌NO的比较 取RAW264.7细胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，调整细胞数目至2×105 cell/mL。于96孔细胞培养板中每孔加入100 μL细胞悬液，置于CO2培养箱中继续培养12 h。取出培养板后吸掉原培养液，每孔加入190 μL无血清培养液。6 h后加入10 μL LPS（终浓度为1 μg/mL）或10 μL TNF-α（终浓度为10 ng/mL）或10 μL IL-1β（终浓度为10 ng/mL），另设正常对照组。加入LPS后，于微孔板振荡器上振荡混匀，置于CO2培养箱中分别继续培养6、12、24、48 h。收集培养上清液，Griss测定NO的含量，计算NO分泌率=（样品孔OD-空白孔OD）/（对照孔OD-空白孔OD）×100%。 2 实验结果
2.1 不同剂量LPS、TNF-α、IL-1β诱导RAW264.7细胞分泌NO的比较
正常对照组RAW264.7细胞分泌NO的量极低，加入不同剂量的LPS、TNF-α或IL-1β刺激后NO分泌量均显著提高。加入0.01、0.10、1.00、10.00 μg/mL刺激后NO分泌量均显著提高，随着LPS剂量的增加，NO的分泌略微增加。加入0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mLTNF-α或IL-1β刺激后NO分泌量均显著提高；随着 TNF-α或IL-1β剂量的增加，NO的分泌量逐渐增加，且有一定的剂量依赖性（图1）。
2.2 LPS、TNF-α、IL-1β刺激RAW264.7细胞不同时间致NO分泌的变化
正常对照组RAW264.7细胞分泌NO的量极低，加入LPS、TNF-α或IL-1β刺激后NO分泌量显著提高。与正常对照组相比，加入LPS或TNF-α6 h后NO分泌量略微提高，随着LPS或TNF-α刺激时间的延长，NO分泌量逐渐增加，12、24、48 h组与正常对照组相比具有显著性差异，其中在48 h时NO分泌量达到高峰期。加入IL-1β在6、12、24、48 h与正常对照组相比均具有显著性差异，其中在48 h时NO分泌量达到高峰期（图2）。 3 讨论
炎症是十分常见而重要的基本病理过程，可发生于机体的任何部位和任何组织，参与人类的大多数疾病。目前临床上常见抗炎药物包括：非甾体抗炎药、糖皮质激素类、生物制剂、中草药制剂等。但这些药物存在疗效不确定、毒副作用明显、价格昂贵等问题。因此，积极寻找有效、不良反应低、能够长期使用的抗炎药物一直是医药工作者关注的热点。建立体外炎症细胞模型具有简单、高效、便捷等诸多优点。因此，以炎症细胞为模型进行抗炎药物的筛选及评价成为科研人员关注的焦点。该文主要通过观察不同剂量LPS、TNF-α、IL-1β诱导RAW264.7细胞不同时间后NO的分泌量，寻找合适的刺激物剂量及刺激时间，为更好地进行抗炎药物的筛选及评价奠定基础。
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NO的过量生成与炎症反应密切相关，是一种重要的炎症介质。正常情况下内皮源性NO具有抑制炎症反应的作用，而在病理情况下诱导型NO合成酶合成大量的NO则有细胞不良反应，加重炎症反应，参与多种疾病的发展[10]。在该实验中，主要通过检测NO的分泌量来评价LPS、TNF-α、IL-1β诱导RAW264.7成为炎症细胞模型的标准。NO的测定采用Greiss法，该方法操作简单，只需一步反应，时间为10 min，并且价格低廉、灵敏度高、可用于大批量的药物筛选或抗炎活性评价。因此，该实验选择通过测定NO含量来初步评价炎症细胞模型。实验结果显示，LPS 在0.01、0.10、1.00、10.00 μg/mL各剂量均可以刺激RAW264.7细胞分泌大量的NO，剂量依赖性不明显。TNF-α、IL-1β在0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL各剂量均可以刺激RAW264.7细胞分泌大量的NO，且具有一定的剂量依赖性。
此外，该研究选取1 μg/mL LPS、10 ng/mL TNF-α或IL-1β刺激RAW264.7细胞的。结果显示，LPS或TNF-α刺激6 h时NO的分泌量与正常对照组无显著性差异，复制模型不成功；仅在12～48 h均可以成功复制模型；而IL-1β在6～48 h均可以刺激NO的大量分泌，有一定的时间依赖性，可成功复制模型。据文献报道，LPS多采用0.2～1 μg/mL刺激RAW264.7细胞18-24 h进行炎症细胞模型的复制[11-13]。Weiwei Li等人采用10 ng/mL TNF-α诱导RAW264.7细胞24 h为炎症细胞模型，进行药物的抗炎活性评价[14]。
综上所述，0.01～1.00 μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞24 h，以及 0.1～100.00 ng/mL的TNF-α或IL-1β刺激RAW264.7细胞24 h均可以成功复制炎症细胞模型。在实验中如何选取LPS、TNF-α、IL-1β的剂量以及刺激时间，炎症细胞模型过重或过轻都不利于抗炎药物的评价或筛选。应综合考虑，结合细胞状态、细胞密度，以及刺激物的纯度、厂家、批次等自身实验条件进行选取。 [参考文献]
[1] A Ariel， Serhan CN. Resolvins and protectins in the termination program of acute inflammation[J].Trends Immunol，2007，28（4）：176-183.
[2] T Lawrence， Willoughby DA， Gilroy DW. Anti-inflammatory lipid mediators and insights into the resolution of inflammation[J].Nat Rev Immunol，2002，2（10）：787-795.
[3] N Fujiwara， Kobayashi K. Macrophages in inflammation[J]. Curr Drug Targets Inflamm Allergy，2005，4（3）：281-286.
[4] E Szliszka， Skaba D， Czuba ZP， et al. Inhibition of inflammatory mediators by
neobavaisoflavone in activated RAW264.7 macrophages[J].Molecules，2011，16（5）：3701-3712. [5] Y Li， Wu Q， Deng Y， et al. D（-）-Salicin inhibits the LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells and mouse models[J]. Int Immunopharmacol，2015，26（2）：286-294.
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[6] Y Song， Dou H， Gong W， et al. Bis-N-norgliovictin， a small-molecule compound from marine fungus， inhibits LPS-induced inflammation in macrophages and improves survival in sepsis[J].Eur J Pharmacol，2013，705（1-3）：49-60.
[7] X Cheng， Gao D， Chen B， et al. Endotoxin-Binding Peptides Derived from Casein Glycomacropeptide Inhibit Lipopolysaccharide-Stimulated Inflammatory Responses via Blockade of NF-kappaB activation in macrophages[J].Nutrients，2015，7（5）：3119-3137.
[8] AL Weaver. Efficacy and safety of the anti-TNF biologic agents[J].Mod Rheumatol，2004，14（2）：101-112.
[9] YX Bo， Song XH， Wu K， et al. Characterization of interleukin-1beta as a
proinflammatory cytokine in grass carp （Ctenopharyngodon idella）[J].Fish Shellfish Immunol，2015，46（2）：584-595.
[10] YR Mahida. The key role of macrophages in the immunopathogenesis of inflammatory bowel disease[J].Inflamm Bowel Dis，2000，6（1）：21-33.
[11] X Chen， Tang SA， Lee E， et al. IVSE， isolated from Inula japonica，suppresses LPS-induced NO production via NF-kappaB and MAPK inactivation in RAW264.7 cells[J].Life Sci，2015（124）：8-15.
[12] HS Park， Choi HY， Kim GH. Preventive effect of Ligularia fischeri on inhibition of nitric oxide in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages depending on cooking method[J].Biol Res，2014， 47（1）：69.
[13] BJ Cha， Park JH， Shrestha S， et al. Glycosyl glycerides from hydroponic Panax ginseng inhibited NO production in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 cells[J].J Ginseng Res，2015，39（2）：162-168.
[14] W Li， Zhao Y， Xu X， et al.Rebamipide suppresses TNF-alpha mediated inflammation in vitro and attenuates the severity of dermatitis in mice[J].FEBS J，2015，282（12）： 2317-2326. （收稿日期：2017-02-11）
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