主导管损伤后SD大鼠下颌下腺的组织学观察

主导管损伤后SD大鼠下颌下腺的组织学观察

摘要 目的 建立主导管损伤的SD 大鼠模型， 观察主导管损伤后腺体的组织学变化。方法 选取8只雄性SD大鼠， 构建SD大鼠主导管损伤模型， 6 d后摘除大鼠的腺体组织进行免疫组织化学染色， 观察腺体组织变化。结果 主导管结扎后第6天， 腺泡结构消失， 腺小叶轮廓清楚。腺泡细胞重组形成管样结构；Ki-67阳性率为74.5%， 在重组区域和导管基膜区层粘连蛋白（LN）、整合素α6β1和CD90.1表达。结论 主导管损伤能促使下颌下腺干/祖细胞开始表达这些潜在特性并分化为腺泡细胞。

关键词 下颌下腺；损伤；干/祖细胞；组织学

正常状态下， 成熟个体组织中的干细胞很少。组织损伤后， 成体干细胞能增殖分化修复损伤组织。本文通过结扎下颌下腺主导管， 构建下颌下腺损伤模型， 观察下颌下腺具有干/祖细胞特征细胞的增殖和功能变化。

1 材料与方法

1. 1 材料 8周龄雄性SD大鼠8只， 体重180～200 g， SPF级。一抗：小鼠抗大鼠整合素α6β1单克隆抗体；小鼠抗人淀粉酶单克隆抗体；兔抗小鼠/大鼠CD90.1单克隆抗体；兔抗大鼠LN多克隆抗体、兔抗大鼠Ki-67多克隆抗体。二抗：Envision两步法抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒， DAB 显色试剂盒。

1. 2 方法

1. 2. 1 动物模型的建立 8只雄性SD大鼠， 采用10%水合氯醛在大鼠腹腔内进行注射麻醉。麻醉生效后， 大鼠固定为仰卧位， 拉伸颈部固定于动物架上；备皮、消毒， 铺巾， 沿颈中线切开；解剖分离双侧下颌下腺主导管；随机双重结扎一侧下颌下腺主导管， 另一侧作为正常对照；分层缝合关闭创面。术后预防感染， 6 d后无菌条件下摘除腺体。将摘除的腺体组织进行免疫组织化学染色。

1. 2. 2 免疫组化染色采用两步法， 按试剂盒使用说明进行操作。

2 结果

主导管结扎6 d后， 下颌下腺腺体减小。腺泡正常结构消失， 腺小叶轮廓清楚。腺泡细胞重组形成管樣结构， 大小不等；部分构成管样结构的腺泡细胞细胞核排列整齐， 远离基底膜区， 胞浆成分减少；管样结构周围有包膜形成。梭形样细胞包绕在管样结构的基底膜区， 胞核扁长。Ki-67免疫组织化学染色可见由腺泡细胞重组形成导管的细胞核呈棕褐色， 胞浆棕黄色。Ki-67阳性率约为74.5%。LN免疫组织化学染色可见在间质和重组的导管细胞基底膜处胞浆棕黄色， 阳性细胞环绕管样结构。CD90.1免疫组织化学染色可见在腺泡结构消失区域较多的细胞胞浆深染， 胞浆呈棕黄色。腺泡细胞重组形成的管样结构中部分

细胞胞浆深染。腺体导管细胞未见深染。Amylase免疫组织化学染色可见较多的细胞胞浆深染， 胞浆呈棕黄色。腺体导管腔面及附近的细胞胞浆深染。α6β1免疫组织化学染色可见在腺泡细胞重组的管样结构中细胞胞浆深染。腺体导管及附近细胞胞浆深染。

对照侧腺体间质， 腺泡细胞及导管细胞Ki-67阳性率<1%。LN、α6β1和CD90.1免疫组织化学染色时， 在腺体间质和导管细胞基底膜区有少数细胞胞浆呈棕黄色， 颜色较浅。腺泡细胞及导管细胞未见表达。Amylase免疫组织化学染色时， 腺泡细胞胞浆呈淡黄色至棕黄色颗粒状着色。导管细胞胞浆淡染。

3 讨论

Ki-67作为评价细胞增殖的指标， 已广泛用于基础和临床研究。本实验中， 主导管结扎的下颌下腺组织中， 大量的腺泡细胞和导管细胞胞核呈棕褐色， Ki-67阳性率为74.5%。对照侧下颌下腺偶见单个细胞核呈棕褐色。主导管结扎后下颌下腺组织中细胞增殖活跃。

在啮齿动物涎腺发育过程中， 涎腺上皮细胞胞浆中存在LN， 胚胎期后逐渐消失， 成年后胞浆中不再表达LN[1]。LN的表达体现了细胞的增殖分化能力。含β1亚基的整合素在细胞的增殖和分化中发挥着重要作用， 胚胎鼠下颌下腺上皮细胞表达α6整合素。用免疫磁珠分选方法在SD大鼠下颌下腺细胞中分选出的α6β1整合素阳性细胞， 在体外培养时具有较高的增殖能力和克隆形成能力。因此， 有学者认为， α6β1和LN双阳性细胞是SD大鼠下颌下腺干/祖细胞的典型特征之一[2， 3]。本实验发现， 主导管结扎6 d后， 在腺泡结构消失区域可见较多的细胞强阳性表达α6β1、LN表达。表明组织损伤模型能激活α6β1及LN阳性细胞， 促使其增殖。人胚胎下颌下腺细胞干/祖细胞CD90.1 表达率为99.69%[4]。主导管结扎后， 腺泡细胞及导管附近的细胞CD90.1阳性表达， 阳性细胞呈丛状分布。组织损伤模型激活CD90.1阳性细胞， 促使其增殖。LN、α6β1和CD90.1阳性表达细胞在对照组腺体组织中位于间质和导管细胞基底膜区， 表明下颌下腺成体干/祖细胞位于该区域；主导管结扎后在腺泡细胞重组的管样结构及基底膜区阳性表达， 表明受到损伤刺激后， 下颌下腺干/祖细胞在这一区域增殖活跃。

在正常涎腺组织中， 只有腺泡细胞的分泌颗粒中存在Amylase， 导管系统细胞中无Amylase。主导管结扎后腺泡细胞及导管细胞中均可见到Amylase阳性表达。腺泡细胞中Amylase表达、深染可能是由于导管结扎后， 腺泡细胞功能未完全消失， 胞浆比例减少， 细胞中分泌颗粒未排出；导管及其附近的细胞中存在Amylase， 提示这些细胞具有腺泡细胞的分泌功能， 具有在体内向成熟腺泡细胞分化的潜能。

综上所述， 导管损伤能促使下颌下腺干/祖细胞开始表达这些潜在特性并分化为腺泡细胞。

参考文献

[1] 黄桂林， 姜群， 王天果， 等. 损伤下颌下腺模型中涎腺干/祖细胞分离及特征的初步研究. 实用口腔医学杂志， 2009， 25（2）： 174-177.

[2] 蒋练， 黄桂林， 姜群， 等.腺体组织损伤后体外分离下颌下腺干/祖细胞后的克隆化培养.中国组织工程研究与临床康复， 2009， 13（49）：9765-9768.

[3] 潘光华， 陈伟， 张霓霓， 等. SD大鼠下颌下腺主导管结扎损伤及再通后的组织学观察.实用口腔医学杂志， 2012， 28（5）：570-573.

[4] 王春宇， 黄桂林， 张霓霓， 等.人下颌下腺干/祖细胞的分离及培养 .中国组织工程研究与临床康复， 2010， 14（45）：8464-8468.