围生期磺胺间甲氧嘧啶暴露对海马mTOR信号通路调控机制的影响

的影响

祝一田;刘心记;魏嵘;张强;陶振男;刘开永

【摘 要】目的 探讨围生期磺胺间甲氧嘧啶暴露对海马雷帕霉素靶蛋白(mTOR)调控机制的影响.方法 选用40只美国癌症研究所(ICR)雌鼠从受孕后第1天(GD1)至仔鼠出生后21d(PND 21),每天分别对其灌服1次10、50和200mg/kg的磺胺间甲氧嘧啶(SMM)和生理盐水,并用气相色谱法测定母鼠粪便中短链脂肪酸(SCFAs),蛋白免疫印迹法检测PND 22和PND 56时雌性子鼠海马中mTOR信号通路相关蛋白的表达.结果 与对照组相比,各SMM处理组母鼠粪便中总短链脂肪酸(SCFAs)和丁酸含量显著下降(P＜0.05);处理组雌性子鼠海马中蛋白激酶B(Akt)和mTOR以及低、中剂量组4E结合蛋白(4EBP1)表达明显增高(P＜0.05);PND56时,处理组磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)和mTOR以及中、高剂量组核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)表达均显著降低(P＜0.05),处理组4EBP1表达明显增高(P＜0.05).结论 围生期母鼠暴露SMM致其肠道菌群紊乱,间接诱导其雌性子代海马mTOR信号通路异常.

【期刊名称】《中国抗生素杂志》 【年(卷),期】2019(044)005 【总页数】7页(P636-642)

【关键词】肠脑轴;短链脂肪酸;雷帕霉素靶蛋白;围生期;抗生素;磺胺间甲氧嘧啶 【作 者】祝一田;刘心记;魏嵘;张强;陶振男;刘开永

【作者单位】安徽医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系,合肥230032;安徽医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系,合肥230032;安徽医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系,合肥230032;安徽医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系,合肥230032;安徽医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系,合肥230032;安徽医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系,合肥230032;人口健康与优生安徽省重点实验室,合肥230032 【正文语种】中 文 【中图分类】R978.1

2013年中国抗生素使用量达到162000吨，其中52%为兽用[1]。磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine,SMM)作为我国生产量和使用量最大的兽用抗生素之一，在牛奶、鸡肉等动物性食品中均有检出[2-3]，并通过多种途径在人体内残留。课题组前期研究发现，围生期母鼠暴露SMM可导致子鼠脂肪沉积，肝脏、肾脏受损以及表现出焦虑，记忆障碍等异常行为[4-5]。研究表明，抗生素暴露是诱导肠道菌群失调的主要因素[6]，可通过影响短链脂肪酸(SCFAs)等菌群代谢物引起肠-脑轴交流障碍，进而影响宿主行为和脑功能[7]。大脑海马中mTOR信号通路的调节控制着神经系统的许多生理功能，包括神经发育，记忆和认知等，如mTOR信号的过度活化可以降低小鼠的空间学习和记忆能力[8]，与课题组前期研究雌性子鼠脑组织中mTOR相关基因的mRNA表达上调结果一致[4]，mTOR信号下调也会诱导大鼠表现出焦虑样行为[9]，但SMM暴露是否对mTOR信号表达有长期影响，及其通过影响肠道菌群代谢而改变精神行为的mTOR调控机制尚未明确。本研究探讨围生期母鼠SMM暴露对粪便中SCFAs含量及子鼠海马mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。

1 材料与方法 1.1 仪器

GC 7890型气相色谱仪，Agilent Technologies Co.ltd.；Centrifuge 5417高速低温离心机，德国Eppendorf公司；色谱柱：DB-FFAP，30m，0.25mm，0.25μm，美国Agilent公司；凝胶成像分析系统Tanon6600、蛋白质转移槽VE-186和蛋白质电泳槽VE180均购于北京天能公司。 1.2 试剂

SMM原料药(有效成分含量为99.8%)，安徽华澳生物技术有限公司；总蛋白BCA测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；所用抗体均购于英国的Abcam公司；乙酸、丙酸、丁酸和2-乙基丁酸(内标)标准品，上海Sigma-Aldrich公司。 1.3 动物的来源与处理

I C R小鼠(S P F级，8周龄)购买于北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2012-0001)，雄鼠20只，雌鼠40只，雄鼠体重(30±2)g，雌鼠为(25±2)g。实验前允其有1周的环境适应期，然后按照常规饲养。晚9点，按雌:雄=2:1进行合笼，次日早上7点查到阴栓者确定受孕，记为怀孕第1天(GD 1)。母鼠随机分为对照组(Control)、低(Low)、中(Middle)、高(High)剂量组，从GD 1至PND 21，对每组10只母鼠分别灌胃给予生理盐水和10、50、200mg/kg剂量的SMM，给药频率为每天1次，给药体积为每100g体重的小鼠给予1mL的生理盐水或不同剂量的SMM。母鼠在PND 22时剖杀，留存其粪便冷冻保存(-80℃)。雌性子鼠分别在PND 22和PND 56时剖杀，取其海马组织冷冻保存(-80℃)。

1.4 短链脂肪酸的测定

高效气相色谱法测定粪便中短链脂肪酸(SCFAs)的含量，具体步骤依据参考文献[10]略有改动，简述如下，称取粪便样品0.06g于1.5mL离心管中，加入600μL

的去离子水浸泡12h，13000r/min离心15min，取上清液100μL，加入内标, 以5mol/L HCl 10μL混均，待进样。 1.5 mTOR信号通路相关蛋白的检测

蛋白免疫印迹法测定mTOR相关蛋白磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、小G蛋白Ras同源蛋白(Rheb)、海马雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)和4E结合蛋白1(4EBP1)的表达，具体步骤依据参考文献[10]，略有改动，简述如下，先进行总蛋白的提取，然后经SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭与抗体孵育，最后显影和凝胶图像分析测定蛋白表达。 1.6 统计分析

采用SPSS 16.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差(x ±s)表示，所有参数采用单因素方差分析，各组之间采用最小显著差法(LSD)两两比较，与对照组相比，P＜0.05视为有统计学意义(*P＜0.05,**P＜0.01，***P＜0.001)。 2 结果

2.1 母鼠粪便中SCFAs含量及比例

如图1所示，与对照组相比，PND 22时，各处理组的总SCFAs含量(乙酸、丙酸和丁酸总含量)、丁酸和中剂量组丙酸含量均显著下降(P＜0.05)。各处理组丁酸与乙酸及与丙酸含量的比值和中、高剂量组丙酸与乙酸含量的比值明显降低(P＜0.05)。

2.2 雌性子鼠海马组织PI3K、Akt的表达

如图2所示，PND 22时，PI3K表达在各剂量组无统计学差异(P＞0.05)，各处理组Akt表达显著增高(P＜0.05)；PND 56时，各处理组PI3K和低、中剂量组Akt表达显著降低(P＜0.05)。

图1 母鼠粪便中SCFAsFig.1 Fecal SCFAs of the damsA：总SCFAs含量；B：乙酸含量；C：丙酸含量；D：丁酸含量；E：丁酸与乙酸的比值；F：丙酸与乙酸

的比值；G：丁酸与丙酸的比值；数据以(x±s)表示，与对照组相比，P＜0.05视为有统计学意义(*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001)

图2 雌性子鼠海马组织PI3K、Akt的表达Fig.2 The expression of PI3K and Akt in the female offspring hippocampusA：PND 22时PI3K相对表达；B：PND 22时Akt相对表达；C：PND 56时PI3K相对表达；D：PND 56时Akt相对表达。数据以均以(x±s)表示，与对照组相比，P＜0.05视为有统计学意义(*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001)

2.3 雌性子鼠海马组织Rheb、mTOR的表达

如图3所示，PND 22时，各处理组Rheb、mTOR表达显著增高(P＜0.05)；PND 56时，各处理组mTOR表达及中，高剂量组Rheb表达明显降低(P＜0.05)。 2.4 雌性子鼠海马组织S6K1的表达

如图4所示，PND 22时，高剂量组S6K1表达显著增高(P＜0.05)，PND 56时，中、高剂量组S6K1表达明显降低(P＜0.05)。 2.5 雌性子鼠海马组织4EBP1的表达

如图5所示，PND 22时，低、中剂量组4EBP1表达显著增高(P＜0.05)。PND 56时，低、中、高剂量组4EBP1表达仍显著增高(P＜0.05)。

以上结果说明，围生期暴露SMM导致母鼠粪便中SCFAs含量显著下降，比值差异增大，并诱导雌性子鼠海马mTOR信号通路相关蛋白表达发生改变，对mTOR信号表达有长期影响。 3 讨论

图3 雌性子鼠海马组织Rheb、mTOR的表达Fig.3 The expression of Rheb and mTOR in the female offspring hippocampusA：PND 22时Rheb相对表达；B：PND 22时mTOR相对表达；C：PND 56时Rheb相对表达；D：PND 56时mTOR相对表达。数据以均以(x±s)表示，与对照组相比，P＜0.05视为有

统计学意义(*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001)

图4 雌性子鼠海马组织S6K1的表达Fig.4 The expression of S6K1 in the female offspring hippocampusA：PND 22时S6K1相对表达；B：PND 56时S6K1相对表达。数据以(x±s)表示，与对照组相比，P＜0.05视为有统计学意义(*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001)

图5 雌性子鼠海马组织4EBP1的表达Fig.5 The expression of 4EBP1 in the female offspring hippocampusA：PND 22时4EBP1相对表达；B：PND 56时4EBP1相对表达。数据以(x±s)表示，与对照组相比，P＜0.05视为有统计学意义(*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001)

随着现代畜牧业和水产养殖业的发展，为了预防和治疗疾病以及提高饲料报酬率，多种抗生素被广泛使用，以致动物性食品中抗生素残留。一项调查结果显示，磺胺类抗生素在鸡肉和猪肉中残留量可达2700和3600μg/kg[11]。本次研究中低剂量组SMM给药量为10mg/kg，研究结果显示，母鼠粪便短链脂肪酸含量以及子鼠mTOR信号表达在低剂量组即可发生改变。有研究表明，饲喂有微量抗生素残留的牛奶即可对小牛的肠道菌群功能带来显著改变[12]，说明抗生素暴露尤其是生命早期暴露会引起宿主肠道菌群失衡[13]。

动物研究显示，阿奇霉素等广谱抗生素处理过的大鼠粪便中SCFAs总量、类型和分布都发生明显的改变[14]。此外，生命早期抗生素暴露诱导小鼠肠道微生物代谢及结构改变，对其脑神经化学和行为学有长期不良影响[15]，提示SCFAs含量及比例可以间接反映肠道菌群结构的变化[16]，通过影响肠-脑轴，介导菌群变化与精神行为异常之间的关联[17]。本研究中母鼠粪便总SCFAs和丁酸含量在各剂量组均显著降低，说明SMM暴露可改变母鼠肠道微生物的代谢。母体孕期的肠道微生物组对婴儿肠道微生物的定殖与发育有重要的影响，且有动物研究表明，孕鼠菌群的改变可传递给后代并长期持续[18]，据此可推测实验中子鼠的肠道菌群稳态

也发生变化，尽管我们并没有检测子代肠道菌群相关指标。此外，将正常小鼠的粪便微生物移植给帕金森氏症(PD)鼠，发现PD小鼠的肠道菌群失调和身体损伤减缓[19]，说明SMM暴露可能通过肠-脑轴对小鼠精神行为产生影响，与本研究中母鼠粪便中短链脂肪酸含量降低，前期研究结果子鼠出现记忆认知障碍结果一致[4]。 研究表明，SCFAs可通过rS6磷酸化的CD4+T细胞激活mTOR通路[20]，同时，SCFAs抑制B细胞中的AMPK(AMP依赖的蛋白激酶)信号从而改变mTOR信号[21]。这些研究提示雌性子鼠海马mTOR信号的改变可能与其粪便中SCFAs含量改变有关。课题组前期结果显示，雌性子鼠大脑中mTOR上下游信号基因的mRNA表达异常，且围生期暴露SMM对雌鼠神经行为学影响更为严重，有性别差异[22]。因此，本实验仅检测雌性子鼠海马组织中mTOR信号通路相关蛋白表达的变化。结果显示，在PND 22时，Akt、mTOR、S6K1和4EBP1的蛋白表达明显升高，且与药物剂量无明显相关性。雌性子鼠在出生前至PND 21持续间接暴露于SMM。有研究发现，低剂量抗生素暴露能够增加脂肪沉积，具有促生长作用，在前期实验中也发现子鼠体重增加，因此我们推测雌性子鼠间接暴露SMM时，肠道菌群结构改变，mTOR信号上调可能是对SMM暴露的代偿性升高。而在PND 56，即雌性子鼠停止SMM暴露5周时，mTOR上游信号Akt和PI3K，以及mTOR蛋白表达下降，mTOR通过磷酸化和钝化转化抑制剂4E-BP，激活S6激酶(S6K)来控制蛋白质的合成[23]，与PND 56时S6K1蛋白表达下降，4EBP1蛋白表达升高结果一致，说明停止暴露后mTOR信号并未恢复到正常水平，SMM暴露对mTOR信号表达有长期影响。mTOR信号中Akt是一种蛋白激酶，对调控细胞的生长，存活以及代谢有重要作用[24]，此外，mTOR分子参与神经系统发生发展的多个过程，除有蛋白激酶功能外，还是一种重要的信号转导分子，在大脑的形成和发育、神经突触的发生、学习和记忆的形成中起重要作用[25]。本研究中，雌性子鼠海马中Rheb表达在PND 22时显著增高，作为mTOR的上游

激活蛋白，Rheb的超表达可抑制神经元的迁移，影响神经元的形态和小鼠大脑皮层的发育[26]，与课题组前期研究结果子鼠记忆受损一致。mTOR信号通路的改变可能与一些引起宿主行为改变的神经性疾病密切相关[27]，mTOR信号下调会对神经活性产生一定的影响，如雷帕霉素(mTOR抑制剂)处理过的大鼠表现出焦虑样行为[9]，说明mTOR信号通路的改变可能引起不良健康结局，如前期研究结果中子鼠行为异常可能与此有关。

肠道菌群可通过与大脑交流诱导脑神经化学及行为的改变[28]，且肠道微生物组成的改变会影响神经系统的生理功能[29]，短链脂肪酸可通过调节大脑中脑源性神经营养因子影响mTOR信号[30]，与本实验短链脂肪酸含量降低，mTOR信号通路改变结果一致，有关更为详细的分子机制有待进一步研究。综上所述，围生期母鼠暴露于SMM后，粪便SCFAs含量显著降低、从而诱导雌性子鼠海马mTOR信号通路发生改变。 参 考 文 献

【相关文献】

[1]Zhang Q Q, Ying G G, Pan C G, et al.Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China: source analysis, multimedia modeling, and linkage to bacterial resistance[J].Environ Sci Technol, 2015, 49(11):6772-6782.

[2]Tang J, Shi T, Wu X, et al.The occurrence and distribution of antibiotics in Lake Chaohu, China: Seasonal variation,potential source and risk assessment[J].Chemosphere, 2015,122: 154-161.

[3]Jin C, Chen Q, Sun R, et al.Eco-toxic effects of sulfadiazine sodium,

sulfamonomethoxine sodium and enrofloxacin on wheat, Chinese cabbage and tomato[J].Ecotoxicology, 2009,18(7): 878-885.

[4]Zhang Q, Zhang D, Liu K Y, et al.Perinatal sulfamonomethoxine exposure influences physiological and behavioral responses and the brain mtor pathway in mouse

offspring[J].Hum Exp Toxicol, 2017, 36(3): 256-275.

[5]Zhang Q, Zhang D, Ye K, et al.Physiological and behavioral responses in offspring mice following maternal exposure to sulfamonomethoxine during pregnancy[J]. Neurosci Lett,2016, 624: 8-16.

[6]Blaser M J.Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome[J].Science, 2016, 352(6285): 544-545.

[7]Tamburini S, Shen N, Wu H C, et al.The microbiome in early life: implications for health outcomes[J].Nat Med,2016, 22(7): 713-722.

[8]Ehninger D.From genes to cognition in tuberous sclerosis:implications for mTOR inhibitor-based treatment approaches[J].Neuropharmacology, 2013, 68(5): 97-105. [9]Hadamitzky M, Herring A, Keyvani K, et al.Acute systemic rapamycin induces neurobehabioral alterations in rats[J].Behav Brain Res, 2014, 273(15): 16-22.

[10]张强.生命早期抗生素暴露致子鼠行为异常: 肠—脑轴mTOR信号通路调控机制[D].安徽: 安徽医科大学, 2017.

[11]Yamaguchi T, Okihashi M, Harada K, et al.Antibiotic residue monitoring results for pork, chicken, and beef samples in Vietnam in 2012-2013[J].J Agric Food Chem,2015, 63(21): 5141-5145.

[12]Pereira R V V, Carroll L M, Lima S, et al.Impacts of feeding preweaned calves milk containing drug residues on the functional profile of the fecal microbiota[J].Scientific Reports, 2018, 8(1): 554.

[13]刘昌孝.肠道菌群与健康、疾病和药物作用的影响[J].中国抗生素杂志, 2018, 43(1): 1-14. [14]Zhao X, Jiang Z, Yang F, et al.Sensitive and simplified detection of antibiotic influence on the dynamic and versatile changes of fecal short-chain fatty acids[J].PloS One, 2016,11(12): e0167032.

[15]Leclercq S, Mian F M, Stanisz A M, et al.Low-dose penicillin in early life induces long-term changes in murine gut microbiota, brain cytokines and behavior[J].Nat Commun, 2017, 8: 15062.

[16]Abdallah Ismail N, Ragab S H, Abd Elbaky A, et al.Frequency of Firmicutes and Bacteroidetes in gut microbiota in obese and normal weight Egyptian children and adults[J].Arch Med Sci, 2011, 7(3): 501-507.

[17]O'toole P W, Jeffery I B.Microbiome-health interactions in older people[J].Cell Mol Life Sci, 2017, 75(1): 119-128.

[18]Schulfer A F, Battaglia T, Alvarez Y, et al.Intergenerational transfer of antibiotic-perturbed microbiota enhances colitis in susceptible mice[J].Nat Microbiol, 2018, 3(2): 234-242.

[19]Sun M F, Zhu Y L, Zhou Z L, et al.Neuroprotective effects of fecal microbiota

transplantation on MPTP-induced Parkinson's disease mice: Gut microbiota, glial reaction

and TLR4/TNF-alpha signaling pathway[J].Brain Behav Immun, 2018, 70: 48-60. [20]Park J, Kim M, Kang S G, et al.Short-chain fatty acids induce both effector and

regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR-S6K pathway[J].Mucosal Immunology, 2015, 8(1): 80-93.

[21]Kim M, Qie Y, Park J, et al.Gut microbial metabolites fuel host antibody responses[J].Cell host microbe, 2016, 20(2):543-547.

[22]Thion M S, Low D, Silvin A, et al.Microbiome influences prenatal and adult microglia in a sex-specific manner[J].Cell, 2018, 172(3): 500-516.

[23]Soulard A, Hall M N.SnapShot: mTOR signaling[J]. Cell,2007, 129(2): 434.

[24]李进, 邹祥.雷帕霉素及其衍生物开发现状、作用机制及生物合成研究进展[J].中国抗生素杂志, 2011, 36(11):806-813.

[25]Tang G, Gudsnuk K, Kuo S H, et al.Loss of mTOR-dependent macroautophagy causes autistic-like synaptic pruning deficits[J].Neuron, 2014, 83(5): 1131-1143.

[26]Subramaniam S, Napolitano F, Mealer R G, et al.Rhes, a striatal-enriched small G protein, mediates mTOR signaling and L-DOPA-induced dyskinesia[J].Nat Neurosci, 2011,15(2): 191-193.

[27]Lee J H, Tecedor L, Chen Y H, et al.Reinstating aberrant mTORC1 activity in

Huntington's disease mice improves disease phenotypes[J].Neuron, 2015, 85(2): 303-315. [28]Collins S M, Surette M, Bercik P.The interplay between the intestinal microbiota and the brain[J].Nat Rev Microbiol,2012, 10(11): 735-742.

[29]Sharon G, Sampson T R, Geschwind D H, et al.The central nervous system and the gut microbiome[J].Cell, 2016,167(4): 915-932.

[30]Maqsood R, Stone T W.The gut-brain axis, BDNF, NMDA and CNS disorders[J].Neurochem Res, 2016, 41(11): 2819-2835.