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鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

来源：世旅网

浙江大学学报(农业与生命科学版)　29(6):

644～648,2003

JournalofZhejiangUniversity(Agric1&LifeSci1)

文章编号:100829209(2003)0620644205

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

吴建祥1,于涟2,龚辉2

(1.浙江大学生物技术研究所,浙江杭州310029;2.浙江大学预防医学研究所,浙江杭州310029)

摘　要:以含鸡传染性法氏囊病病毒(杭州分离株,HZ96)VP2基因的质粒PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.5kb左右长的VP2基因产物;用Kpn󰂪和Sal󰂪酶切纯化的PCR产物;将纯化的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下定向克隆到植物表达载体Cambia1301水稻胚乳特异性启动子GT1下游,并经PCR、酶切和测序鉴定。植物重组表达载体经三亲交配已导入根癌农杆菌中。关　键　词:鸡传染性法氏囊病病毒;VP2基因;植物表达载体;水稻胚乳特异性启动子GT1中图分类号:S858.31;Q786　　　文献标识码:A

WUJian2xiang1,YULian2,GONGHui2(1.InstituteofBiotechnology,zhejianguniversity,Hangzhou310029,China2.InstituteofPreventiveVeterinaryMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China)

.JournalofZhejiangPlantexpressionvector’sconstructionofVP2geneofinfectiousbursaldiseasevirusUniversity(Agric1&LifeSci1),2003,29(6):6442648

Abstract:TheVP2geneofinfectiousbursaldiseasevirus(IBDV,HZ96strain)wasamplifiedbypoly2merasechainreactionwithspecialprimerscontainingKpn󰂪andSal󰂪.ThepurifiedPCRproductwasdigestedbyrestrictedenzymesKpn󰂪andSal󰂪.ThedigestedandpurifiedVP2geneofinfectiousbur2saldiseaseviruswasclonedintoplantexpressionvectorCambia1301thatcontainsriceendosperm2spe2cificpromoterGT1.TheresultshowsthatCambia1301withVP2genewassuccessfullytransferredintoAgrobacteriumtumefaciens(Aotumefaciens)bymethodoftriparentalmating.

Keywords:infectiousbursaldiseasevirus;VP2gene;plantexpressionvector;riceendosperm2specific

promoterGT1

　　传染性法氏囊病是鸡的一种急性高度接触

性传染病,目前在世界养鸡的国家和地区广泛流行,也是我国近几年来严重威胁养鸡业的重要传染病之一。其一方面死亡率高,淘汰率增

加;另一方面导致免疫抑制,使多种其它疾病(如传染性支气管炎,新城疫,马立克氏病)的有效疫苗对鸡的免疫应答下降,造成免疫失败,使鸡对病原易感性增加,造成巨大的经济损失[1]。

　　收稿日期:2003207216

基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(301303).

作者简介:吴建祥(1968—),男,浙江诸暨人,硕士,讲师,主要从事免疫学和分子生物学研究.Tel:0571286971677;E2mail:

hzwjxi@yahoo.com.cn.

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该病目前无特效的治疗方法,主要依靠弱毒疫苗或灭活疫苗来预防,但是,应该指出,在使用

弱毒疫苗或灭活疫苗过程中存在着一些问题有待解决:①安全性问题。弱毒活疫苗存在免疫不全、疫苗外源性或垂直传播性病原污染以及疫苗接种动物后毒力返强的危险,常导致变异株的不断出现,造成恶性循环;②灭活疫苗价格昂贵。灭活疫苗由于抗原需要量大,制备成本高,造成价格长期居高不下;③灭活疫苗接种较麻烦,需注射,且引起局部疼痛和其它不适等,对鸡造成一定的损害。因此研究安全、廉价、广谱的基因工程疫苗一直是各国研究的热点。IBDV基因组由A股双链RNA(Seg.A)和B股双链RNA(Seg.B)组成。Seg.A至少有两个ORF,其中,ORFA1编码N2VP22VP42VP32C多聚蛋白,经加工后成为成熟的VP2、VP4和VP3。VP2占病毒总蛋白51%,是主要宿主保生产外源蛋白的理想农作物;第二,基因枪及农杆菌介导外源基因表达技术已十分成功地应用

于水稻的遗传转化,国内外已有许多转基因水稻的报道。

　　自从20世纪80年代初期以来,国内外对IBDV的研究已取得长足进展,已有关于IBDV痘苗病毒等载体中VP2基因在昆虫杆状病毒、

进行表达的报道,但尚无IBDVVP2基因在植物中进行表达的研究报告,为了探讨植物表达家禽病毒基因的可能性,笔者利用已获得的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因成功地构建了植物表达载体系统。

1　材料与方法1.1　菌种及质粒护性抗原,另外VP2还与IBDV的毒力及抗原变异有密切关系[2,3]。因此,VP2成为研究分子防治I“热点”基因。BDV策略的　　转基因植物生产疫苗是Mason于1992年提出的。该技术是利用分子生物学技术把重组的疫苗基因导入植物,并使植物大量表达的一类生物技术。目前该技术已成为疫苗研究的一大热点。植物作为生产基因工程疫苗的生物反应器具有许多潜在的优势:①植物细胞具有与动物细胞相似的结构和功能有利于重组蛋白的准确组装和表达,使表达产物具有免疫原性和生物活性;②用转基因植物生产疫苗,需要的仅是阳光、水和肥料;③植物细胞具有全能性,能够再生植株,且植物细胞中绝对不会含有潜在的动物或人类病原而更安全可靠;④重组基因工程疫苗可长期稳定地贮存于植物器官或组织,有利于保存和运输;⑤直接以植物的可食用部分进行口服免疫,既可减去纯化过程,降低生产成本,又可避免烦琐的接种程序。且与皮下注射免疫相比,转基因植物产生的亚基或可溶性抗原的口服免疫常常在刺激免疫反应方面效率较高,只需要少量的抗原。而水稻作为生物反应器生产IBD基因工程疫苗的优点是:第一,在粮食作物中,水稻具有举足轻重的地位,且稻米中蛋白质含量较高,约占10%,因此是

　　大肠杆菌DH5Α,根癌农杆菌EHA105,含水稻胚乳特异性启动子GT1的植物表达载体Cambia1301,含辅助质粒PBK2013的HB101和含IBDVVP2基因的PBS质粒系本所保存。1.2　酶及试剂

　　所有酶购自Promega公司,PCR纯化Kit和割胶回收Kit均为德国QIAGEN公司产品,所有抗生素均为国产分析纯试剂。1.3　PCR引物设计与合成

　　参照Yu,etal.(2000)设计[4],并作适当改进,为了便于与Cambia1301质粒的多克隆位点相连接,在引物5′端引入Kpn󰂪酶切位点,在引物3′引入Sal󰂪酶切位点。PCR引物由上海生工中心合成。引物的具体序列如下:　　5′端引物为5′:

　　AGGGTACCATGACAAACCTGCAAGATCAA23′　　3′端引物为5′:

　　ACGTCGACTTAAGTCAGCTGCCTTATGCGGCC23′1.4　PCR扩增鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因

　　在PCR反应管中依次加入下列试剂10×TaqPlusIPCRbuffer10ΛL,25mmol󰃗LMgCl26ΛL,10mmol󰃗LdNTP混合物2ΛL,20Λ、3’端引物各1Λmol󰃗L5’L,含IBDVVP2基因的pBS质粒1ΛL,灭菌MilliQ水

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78.5ΛL,TaqPlusI(5u󰃗ΛL)0.5ΛL,混匀后在

表面加入2滴液体石腊。然后在PCR仪上94℃预变性2min后,94℃45s,57℃40s,72℃2min,共计30个循环进行扩增,最后一个循环后,72℃延伸10min。

1.5　鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物重组表达载体的构建及鉴定

　　用PCR产物纯化Kit纯化PCR产物。纯化的IBDVVP2基因PCR产物用Kpn󰂪和Sal󰂪在37℃酶切2h;Cambia1301质粒用Kpn󰂪和Sal󰂪在37℃酶切3h。酶切产物用QIAGEN公司的GelExtractionKit割胶回

生长期时等体积混合,离心弃上清50ΛLLB悬

浮,涂布于LB固体平板上,过夜培养;用少量培养基洗下菌落,并适当倍比稀释后,涂布于含Rif、Km、Sm的LB固体平板中培养,24h后长出的菌落按常规的碱法提取质粒,进行PCR鉴定。

2　结　果

2.1　鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的PCR

结果

　　PCR扩增后,取10ΛL产物经1%琼脂糖电泳,可观察到一条约1.5kb片段,与预期的IBDVVP2基因大小一致。2.2　鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物重组表达载体的构建和鉴定　　将酶切纯化的PCR产物经Kpn󰂪和Sal󰂪进行双酶切后定向插入到经相同酶切过的Cambia1301载体水稻胚乳特异性启动子GT1的下游,构建成含IBDVVP2基因的中间载体,在含Km(50Λg󰃗mL)的培养基上筛选重组子,经PCR和双酶切后,电泳分析表明,植物中间表达载体中确实插入了1.5kb左右的基因条带(图2,图3).同时核酸测序进一步表明,VP2基因已插入表达载体中。

收。两种酶切产物在4℃条件下用T4DNA

连接产物全部转化DH5Α感Lingase连接过夜。

受态细胞,在含卡那霉素50Λg󰃗mL的LB固体培养基上挑取单菌落接种,碱法提取重组质粒,用PCR、Kpn󰂪和Sal󰂪双酶切和测序鉴定重组质粒。重组表达载体的构建策略如图1。图1　VP2基因植物表达载体的构建

Fig.1　Theconstructionofplantexpressionvecter

ofVP2gene

　　(1～7)2重组质粒PCR扩增产物;82非重组质粒

Cambia1301质粒的PCR扩增产物;M21kb的DNAMarker.

1.6　鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物重

组表达载体转化根癌农杆菌

　　受体农杆菌EHA105于液体含利福平100Λg󰃗mL的YEP培养基中28℃振摇培养,含帮助质粒pRK2013的菌株HB101和含目的质粒的菌株DH5Α接种于含卡那霉素50Λg󰃗mL的LB培养基中,37℃振摇培养。3种菌长到对数

图2　重组质粒VP2基因PCR扩增产物

Fig.2　PCRproductofVP2geneof

recombinantplasmid

2.3　重组表达载体的根癌农杆菌转化与鉴定

　　以pRK2013为辅助质粒,通过三亲交配的方式转化农杆菌。在含Km(50Λg󰃗mL)和Rif

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棉等)。作为生物反应器,它在生物医药方面具有巨大的潜在优势。其中植物转基因疫苗的研

究领域已引起研究人员的重视[5]。通过10年的研究,初步表明用植物制备疫苗的可行性。已有人报道用烟草、马铃薯、香蕉等植物表达HbsAg

[5～7]

;西红柿表达狂犬病病毒外壳蛋

　　(1～5)2重组质粒经Kpn󰂪和Sal󰂪双酶切后的电泳条带;M21kb的DNAMarker.

图3　重组质粒酶切鉴定结果

Fig.3　Restrictedenzymedigestionidentificationof

recombinantplasmidwithKpn󰂪andSal󰂪

白[8];马铃薯、烟草表达诺沃克病毒外壳蛋白、霍乱抗原、大肠杆菌肠毒素B亚基、鸡传染性支气管炎病毒S1基因[9～14];马铃薯、玉米、烟草表达猪传染性肠胃炎病毒的S蛋白等[15～17],表达产物均能诱导机体产生特异性的抗体,具有良好的免疫原性。转基因植物疫苗与常规疫苗及其他新技术疫苗相比,具有生产简单,安全,廉价及保存和运输方便等优点。在疫苗研究中,如何利用转基因植物开发新一代疫苗—植物疫苗是目前世界各国新型疫苗研究的热点之一。为此,我们率先利用鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因成功构建了植物表达载体,并转化根癌农杆菌,为进一步分析转基因水稻表达的IBDVVP2基因产物的免疫原性及鸡传染性法氏囊病植物疫苗的研究打下基础。虽然转基因植物疫苗具有上述许多优点,但目前仍处于研究开发的初期,存在着诸如植物生产外源蛋白的免疫原性、表达水平及低糖基化等问题。但用植物生产外源蛋白质却是一个非常具有吸引力和安全的廉价生产系统。

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(100Λg󰃗mL)的YEP培养基上筛选转化体,挑

取20个单菌落接种,用碱法抽提质粒,并以该

质粒为模板,以VP2基因的特异引物进行PCR扩增。结果表明:100%的转化子均能扩增出与VP2基因大小相同的片段,即1.5kb的条带,而阴性对照未能扩增出相应的片段(图片4)。

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图4　转化子的PCR鉴定

Fig.4　IdentificationoftransformantbyPCR

3　讨　论

　　疫苗是控制疫病流行的最重要手段,现有的弱毒活疫苗和灭活苗在控制IBD的流行过程中发挥了重要作用。然而他们各自的缺陷又给疫病的控制造成了新的困难,研制广谱、有效、安全的新型疫苗是人类和动物疫病控制的核心。上一世纪80年代以来,植物转基因工程不仅在植物本身品质性状的改良及创造新品种方面取得了许多瞩目的成就(如抗病水稻,抗虫

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浙江大学农学院在蔬菜害虫防治研究领域取得突破性进展

适时施用高效低毒农药,充分发挥天敌的自然控制作用,就可以使化学农药用量下降30%～60%,能有效控制害虫,保证蔬菜产品安全。由农业与生物技术学院应用昆虫科学研究所教授刘树生为主的课题组经过4年多的合作攻关,首次针对十字花科蔬菜,在作物系统水平上提出并建立了一套对害虫和天敌进行综合调控的技术体系。1月15日,中国农科院研究员郭予元院士、浙江大学教授陈子元院士等专家在对这项成果进行鉴定时认为,这是我国十字花科蔬菜害虫防治上取得的突破性进展。这项成果已在浙江、上海等10多个主要蔬菜商品生产基地示范推广26.6万hm2。示范区内化学农药用量下降30%～60%,蔬菜产品农药残留经检验全部合格,社会效益巨大,已获经济效益3.37亿元。

这项名为“十字花科蔬菜害虫及天敌综合调控”的研究课题,是中国国家科技部和澳大利亚国际农业研究中心的中澳政府间农业研究合作项目,后被浙江省科技厅列为重大项目进行研究攻关。项目由浙江大学承担,浙江省农业厅、浙江省农科院及上海市农科院协作。现已发表论文52篇,其中SCI期刊9篇。专家认为,这一研究成果能有效地解决长期以来蔬菜害虫防治上依赖单项高效“杀灭”技术带来的危害,将给蔬菜害虫防治带来新的思路,提供新的技术体系。

——浙江大学农业与生物技术学院　　　　

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