一种污泥中提取生物合成材料聚β-羟基丁酸(PHB)的方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112708642 A(43)申请公布日 2021.04.27

(21)申请号 202011436726.1(22)申请日 2020.12.11

(71)申请人 辽宁大学

地址 110000 辽宁省沈阳市沈北新区道义

南大街58号(72)发明人 包红旭　王淑桐　胡家伟　刘洪源　

巨承文　延晨波　王翰林　贾浩琛　苗贺　(74)专利代理机构 沈阳杰克知识产权代理有限

公司 21207

代理人 金春华(51)Int.Cl.

C12P 7/42(2006.01)C08G 63/78(2006.01)C08G 63/06(2006.01)

权利要求书1页 说明书3页 附图2页

C02F 11/00(2006.01)G01N 21/33(2006.01)

CN 112708642 A(54)发明名称

一种污泥中提取生物合成材料聚β-羟基丁酸(PHB)的方法(57)摘要

本发明公开一种污泥中提取生物合成材料聚β‑羟基丁酸(PHB)的方法。包括如下步骤：取活性污泥离心，蒸馏水洗涤，再次离心；离心后的湿菌体，加入SDS溶液，水浴处理；处理后的菌液离心，弃上清液，加入次氯酸钠溶液，水浴处理，洗涤沉淀，于烘箱中烘干；菌体中加入氯仿溶液，抽提，获得PHB的氯仿溶液；加热该溶液除去氯仿；加入浓硫酸，水浴加热，冷却至室温并混匀；测定含有PHB硫酸溶液的DO值，对照标准曲线即可得出PHB含量。经本发明的方法分析检测聚β‑羟基丁酸(PHB)，本发明确定的方法，防止污泥对环境造成二次污染以及污泥中PHB资源浪费，极大的减少了对环境的污染，测定结果误差小，所需费用低。

CN 112708642 A

权　利　要　求　书

1/1页

1.一种污泥中提取生物合成材料聚β‑羟基丁酸(PHB)的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取活性污泥离心，蒸馏水洗涤，再次离心；2)离心后的湿菌体，加入SDS溶液，搅拌均匀，水浴处理；处理后的菌液离心，弃去上清液，

3)加入次氯酸钠溶液，水浴处理，洗涤沉淀，于烘箱中烘干；4)菌体中加入氯仿溶液，抽提，获得PHB的氯仿溶液，加热该溶液除去氯仿；5)加入浓度为98％浓硫酸，水浴加热，使PHB溶解，冷却至室温并混匀；6)测定含有PHB硫酸溶液的DO值，对照标准曲线即可得出PHB含量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述离心，离心机的转速为6000r/离心20‑25分钟。min，

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述水浴，水浴处理的温度是35℃，时间是10min；所述离心，离心机的转速是1500r/min.离心12min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，加入的次氯酸钠溶液的PH值是9.6。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述水浴，水浴温度为350℃，时间是5min；所述洗涤沉淀，蒸馏水洗涤一次，丙酮洗涤一次。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述烘干，烘干温度为75℃。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述抽提，抽提的温度是65℃，时间是1h。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述加热，加热温度为70‑80℃。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中，所述水浴，水浴温度为110℃，时间为10min。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中，测定含有PHB硫酸溶液的DO值所用波长为235nm。

2

CN 112708642 A

说　明　书

1/3页

一种污泥中提取生物合成材料聚β‑羟基丁酸(PHB)的方法

技术领域

[0001]本发明属于生物合成材料领域，具体涉及一种污泥中提取生物合成材料聚β‑羟基丁酸(PHB)的方法。

背景技术[0002]聚β‑羟基丁酸(poly‑β‑hydroxybutyric acid,PHB)具有良好的生物降解性，其分解产物可全部为生物利用，对环境无任何污染；在物理性质和分子结构方面与聚丙烯很类似，在物理性质和分子结构方面与聚丙烯很类似，如分子量、软化点、结晶度、抗张强度等，只是抗冲击强度和耐溶性能较差，聚β‑羟基丁酸与其他无机填充物或化学合成材料相配合，使抗冲击性和耐溶性得到改善，可制备优良的可降解塑料，解决当前危害严重的“白色污染”问题。聚β‑羟基丁酸具有生物降解性、生物相容性和光学活性等，并且可利用再生资源进行生物合成，使它在农业、医药、环保、光学等领域具有广阔的应用前景。[0003]污水处理中，微生物的胞内储存物为聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，简称PHAs)，它的主要成分是聚‑β‑羟基丁酸酯(PHB)，聚‑β‑羟基戊酸酯(PHV)和聚‑β‑羟基‑2‑甲基戊酸酯(PH2MV)，如何从中提取出聚‑β‑羟基丁酸酯(PHB)目前没有方便、准确、可靠的方法。

1

[0004]聚β‑羟基丁酸(PHB)的检测方法主要有染色法、重量测定法、气相色谱检测法、H‑NMR检测法和分光光度法,最早采用苏丹黑、罗蓝、尼罗红对PHB进行初步的定性分析，是一

但由于染色的工作量大，荧光反应不灵敏而限制了它的使用种快速的检测胞内PHB的方法，

范围；重量法测定时需要的活性污泥量大，处理过程复杂，影响因素较多，所以重量分析法并不常用；气相色谱法对PHB纯度要求较高，且气相色谱仪价格高，所以气相色谱法不常用，核磁共振法经常用于PHB的结构分析，该方法在不破坏细胞的情况下就可以进行分析，有利于对发酵时间的控制，但仪器设备昂贵，分析过程也比较复杂；分光光度法是利用次氯酸盐将细胞消化后，通过分光光度法测定PHB所造成的浊度来测定PHB含量，SDS溶液可以利用热浓硫酸将细胞中PHB转化为丁烯酸，通过波长235nm处的光吸收来检测PHB的含量，是一种安全环保的检测方法。

发明内容

[0005]本发明目的是为了克服上述“白色污染”问题，防止污泥对环境造成二次污染以及污泥中PHB资源浪费，降低分析检测所需成本，提供一种污泥中提取生物合成材料聚β‑羟基丁酸(PHB)的方法，既处理了污泥，又降低了合成费用，得到的产物其性能比单一菌株在纯碳源培养得到的PHB要优越。[0006]为实现本发明目的，本发明采用的技术方案为：一种污泥中提取生物合成材料聚β‑羟基丁酸(PHB)的方法，包括如下步骤：[0007]1)取活性污泥离心，蒸馏水洗涤，再次离心；[0008]2)离心后的湿菌体，加入SDS溶液，搅拌均匀，水浴处理；处理后的菌液离心，弃去

3

CN 112708642 A

说　明　书

2/3页

上清液，

[0009]3)加入次氯酸钠溶液，水浴处理，洗涤沉淀，于烘箱中烘干；[0010]4)菌体中加入氯仿溶液，抽提，获得PHB的氯仿溶液，加热该溶液除去氯仿；[0011]5)加入浓度为98％浓硫酸，水浴加热，使PHB溶解，冷却至室温并混匀；[0012]6)测定含有PHB硫酸溶液的DO值，对照标准曲线即可得出PHB含量。[0013]上述的方法，步骤1)中，所述离心，离心机的转速为6000r/min，离心20‑25分钟。[0014]上述的方法，步骤2)中，所述水浴，水浴处理的温度是35℃，时间是10min；所述离心，离心机的转速是1500r/min.离心12min。[0015]上述的方法，步骤3)中，加入的次氯酸钠溶液的PH值是9.6。[0016]上述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述水浴，水浴温度为350℃，时间是5min；所述洗涤沉淀，蒸馏水洗涤一次，丙酮洗涤一次。[0017]上述的方法，步骤3)中，所述烘干，烘干温度为75℃。[0018]上述的方法，步骤4)中，所述抽提，抽提的温度是65℃，时间是1h。[0019]上述的方法，步骤4)中，所述加热，加热温度为70‑80℃。[0020]上述的方法，步骤5)中，所述水浴，水浴温度为110℃，时间为10min.[0021]上述的方法，步骤6)中，测定含有PHB硫酸溶液的DO值所用波长为235nm。[0022]本发明的有益效果是：克服“白色污染”问题，防止污泥对环境造成二次污染以及污泥中PHB资源浪费，降低分析检测所需成本，提供一种生物合成材料聚β‑羟基丁酸(PHB)的方法，既处理了污水，又降低了合成费用，得到的产物其性能比单一菌株在纯碳源培养得到的PHB要优越，极大的减少了对环境的污染，测定结果误差小，所需费用低。附图说明

[0023]图1是实施例1中不同时间对湿菌体破壁效果的有影响效果。[0024]图2是实施例1中不同SDS浓度对湿菌体破壁效果的影响效果。[0025]图3是实施例2中PHB标准曲线的绘制。

具体实施方式

[0026]下面结合具体实施例来进一步描述本发明。[0027]实施例1

[0028]一种污泥中提取生物合成材料聚β‑羟基丁酸的方法，包括如下步骤：[0029]1)取5ml活性污泥，于离心机6000r/min转速下离心25min，蒸馏水洗涤，再次离心，6000r/min转速下离心20min；[0030]2)离心后的湿菌体，加入5ml浓度为10g/L的SDS溶液，35℃水浴处理10min，处理后的菌液以1500r/min转速离心12min，弃去上清液；[0031]3)加入2.5ml PH为9.6、浓度为5g/L的次氯酸钠溶液，350℃水浴处理5min，用蒸馏水洗涤沉淀一次，再用丙酮洗涤沉淀一次，于烘箱中75℃烘干；[0032]4)菌体中加入5ml氯仿溶液，65℃抽提1h，吸取0.5ml含PHB的氯仿溶液于磨口试管中，加热至80℃除去氯仿；[0033]5)加入10ml浓硫酸，盖上玻璃塞，100℃水浴加热10min，冷却至室温并混匀；

4

CN 112708642 A[0034][0035]

说　明　书

3/3页

6)在235nm波长处测定含有PHB硫酸溶液的DO值，对照标准曲线即可得出PHB含量。所得到的聚β‑羟基丁酸的结构式如下：

[0036]

实施例2不同处理时间和不同SDS浓度对湿菌体的破壁效果的影响

[0038]不同处理时间和不同浓度SDS对湿菌体的破壁效果,如图1、2所示,当处理时间t为

或当CSDS为10g/L(t＝10min)时，PHB10min(CSDS＝10g/L)时PHB提取率达到最大，为36.6％，

提取率均达到最大,为37.6％。随着处理时间的延长和CSDS增加,提取率都呈下降的趋势。[0039]实施例3 PHB标准曲线的绘制及含量测定[0040](一)PHB标准曲线的绘制

[0041]1)精确称取0.0095gPHB标准品，加入50ml三氯甲烷，充分溶解，此时PHB浓度为100ug/ml；

[0042]2)将PHB、三氯甲烷混合溶液分别稀释至0.5ug/ml、1.0ug/ml、1.5ug/ml、2.0ug/ml、3.0ug/ml、3.5ug/ml，分别取1ml置于21支干燥带塞比色管中(每个浓度各三支)；[0043]3)加热除去三氯甲烷，加入10ml浓硫酸，用塞封闭比色管，100℃水浴加热20min后冷却，充分混匀；

[0044]4)以浓硫酸为空白对照，采用紫外分光光度计在235nm处OD值为纵坐标，做一条曲线，即为PHB浓度‑235nmOD值关系标准曲线，如图3所示。[0045](二)PHB含量测定

[0046]配制抽提液V(三氯甲烷)∶V(无水乙醇)＝2∶1，准确称取0.01g干菌体，加入10ml配制的抽提液，并对其进行60℃抽提1h，浓H2SO4100℃处理10min，用紫外可见分光光度计在235nm处测OD值，并通过PHB定量标准曲线计算其含量为56.2％。

[0037]

5

CN 112708642 A

说　明　书　附　图

1/2页

图1

图2

6

CN 112708642 A

说　明　书　附　图

2/2页

图3

7