动物医学进展。２０１４，３５（１）：４１—４５ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 土源枯草芽胞杆菌的分离鉴定及生物学特性研究 秦 瑶△，王 苇△，郭秉娇，王熙楚，周 霞 ，王晓兰 （石河子大学动物科技学院，新疆石河子８３２００３） 摘 要：从土壤中采集样品分离枯草芽胞杆菌，检测分离株的生物学特性进而筛选出性状优良的益生 菌。采集土样采用倾注培养法，通过培养特征、形态观察及生化鉴定，结合特征性１６ Ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲ扩增及序 列分析鉴定菌株；采用平板稀释法对分离株进行了耐酸性试验、耐胆盐试验、耐高温试验及耐药试验。从２３ 份土壤中分离鉴定出１０株枯草芽胞杆菌，其中２个菌株具有耐高温、耐胆碱、耐酸及耐药作用等良好的益生 茵特性。 关键词：枯草芽胞杆菌；分离；鉴定；生物学特性 中图分类号：￥８５２．６１６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１４）０１—００４１—０５ 抗生素等药物性饲料添加剂已对禽畜业的发展 和人类健康造成了严重的威胁，欧洲等国家早已严 格控制甚至禁止抗生素的使用，我国对此也十分的 重视。积极寻找和开发具有无毒、无副作用及抗生 素功能的替代品成为当务之急，于是微生物生长促 进剂和益生菌饲料添加剂就应运而生。目前我国允 株的耐高温、耐酸、耐胆盐及对抗菌药物敏感程度等 一系列生物学特性进行了研究，为后续试验以及微 生态饲料添加剂的开发及应用奠定基础。 １材料与方法 １．１ 材料 ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ １ ２００购自广东东盛生物工程有限公司。 ＬＢ培养基、木糖试验、果糖试验、葡萄糖试验、 甘露醇试验、ＶＰ试验、柠檬酸盐试验、淀粉水解试 验、明胶水解试验、过氧化物酶试验、吲哚试验所需 许作为生态制剂的微生物有乳酸菌制剂、粪肠球菌 制剂、芽胞杆菌制剂、酵母菌制剂和复合微生态制剂 等。但通常使用的益生菌株的抗逆性较差，不耐热， 在饲料加工过程中损失较大，不能像芽胞杆菌那样 直接加到配合饲料中，因此作为益生菌的一种，芽胞 杆菌因其特有的生物特性成为研究热点［１ ］。 枯草芽胞杆菌是一种嗜温、好氧、产芽胞的杆状 细菌，其生理特征多样，对人畜无毒无害，不污染环 试剂均根据相关文献配制＿７ ；药物敏感性试验纸片： 青霉素（Ｐ）、四环素（ＴＥＴ）、红霉素（Ｅ）、氨曲南 （ＡＴＭ）、头孢氨苄（ＣＬ）、哌拉西林（ＰＩＰ）、复方新诺 明（ＳＸＴ）、甲氧苄啶（ＴＭＰ）、氟苯尼考（ＦＬＯ）、特治 星（ＴＺＰ），购自杭州微生物试剂有限公司。 １．２ 方法 境，菌体在生长过程中产生的枯草菌素、多黏菌素、制 霉菌素、短杆菌肽等活性物质对致病菌或内源性感染 的条件致病菌有明显的抑制作用 ］。有研究报道，对 从土壤或斑点叉尾鱼回肠中分离筛选的芽胞杆菌菌 株进行了体外拮抗以及按不同剂量添加饲料饲喂鲶 １．２．１ 土样的采集 取自石河子大学校园内土壤 表层５ ｃｍ～１０ ｃｍ下的肥土共计２３份，每份５０ ｇ， 分别放入灭菌的三角瓶中带回实验室备用。 鱼等试验，结果表明该菌株作为益生菌饲料添加剂对 调解鲶鱼养殖中疾病控制有良好的潜力ｌ＿６］。研究显示 用枯草芽胞杆菌饲喂的肉鸡，其巨噬细胞吞噬等功能 有明显提高，这说明枯草芽胞杆菌可以使肉鸡的免疫 作用得到一定的调节ｌ７］。 本试验采用常规细菌分离鉴定法结合分子生物 学方法从土样中分离鉴定枯草芽胞杆菌，并对分离 １．２．２ 细菌培养方法 称取肥土５ ｇ放入含有 ４５ ｍＬ水的三角瓶中，摇动片刻，然后小火加热至悬 浊液沸腾，维持１５ ｍｉｎ。而后静止５ ｍｉｎ，吸取上层 液０．１ ｍＬ加入到含有４．５ ｍＬ无菌水的试管中，制 成１：１００浓度的悬液，然后分别吸取１Ｏ 和１Ｏ 土壤悬浊液各０．２ ｍＬ滴加到ＬＢ培养基平板上（每 种稀释度３个平板），用涂布棒均匀涂布，并将培养 收稿日期：２０１３－０８—０８ 基金项目：石河子大学重大科技攻关项目（ｇ￣ｓ２０１１－ｚｄｇｇ０１—０４）；国家自然科学基金项目（３１１６０５Ｏ７） 作者简介：秦 瑶（１９８８一），女，新疆哈密人，硕士研究生，主要从事兽医微生物学研究；王 苇（１９８７一），男，陕西汉中人， 硕士研究生，主要从事兽医微生物学研究。△同等贡献作者＊通讯作者 ４２ 动物医学进展２０１４年第３５卷第１期（总第２４７期） 基倒置于３７℃恒温培养１ ｄ～２ ｄｌ８ｊ。 １．２．３ 菌株的初步鉴定 挑选呈单个、灰白色、不 规则、菌落边缘不整齐、表面粗糙的干燥型菌落进行 革兰染色镜检、观察并进行纯培养。对革兰阳性、有 芽胞的菌落进行生化鉴定，包括木糖试验、果糖试 验、葡萄糖试验、甘露醇试验、ＶＰ试验、柠檬酸盐试 验、淀粉水解试验、明胶水解试验、过氧化物酶试验、 吲哚试验等 Ｊ。 １．２．４枯草芽胞杆菌的分子生物学鉴定 １．２．４．１基于１６ Ｓ ｒＲＮＡ引物设计及反应条件应 用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件设计上下游引物ｋ１与ｋ２。 ｋｌ：５ 一ＧＣＧＧＣＴＴＣＧＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴＡＴ一３ ，ｋ２： ５ 灭菌２０ｍｉｎ后，接种活化的体积分数为１０ 的枯 草杆菌菌液，３７℃恒温培养，每隔２ ｈ，用无菌生理 盐水以１Ｏ倍依次递减稀释，进行平板菌落计数，测 ０ ｈ～６ ｈ的活菌变化情况。 １．２．６ 耐胆盐试验 用胆盐将ＭＲＳ液体培养基 胆汁盐含量分别调为１、２、３、４ ｇ／ｋｇ，于１２１。Ｃ灭菌 １５ ｍｉｎ。将活化的体积分数１０ 的枯草芽胞杆菌 培养液接种于胆盐培养基中，３７℃培养，每隔１ ｈ， 用无菌生理盐水以１Ｏ倍递减依次稀释，进行平板菌 落计数，测定０ ｈ～４ ｈ活菌数变化情况。 １．２．７热处理对样品抑茵活性的影响 样品分别 在５０℃、８Ｏ℃、１００、１２１。Ｃ水浴中处理２０ ｍｉｎ，用 ＣＴＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＴＣ（ ３ ，片段大小为 ４３９ ｂｐ，由北京华大基因工程有限公司合成。 无菌生理盐水以１０倍递减依次稀释，进行平板菌落 计数。 １．２．８抗茵类药物敏感性试验选择常用１Ｏ种抗 ＰＣＲ体系：ｄｄＨ ２ Ｏ １４／，Ｌ １０×ｂｕｆｆｅｒ ２．５ Ｌ ｄＮＴＰｓ ２ Ｌ，上游引物２ Ｌ，下有引物２ Ｌ，模板 ２ Ｌ，Ｔａｑ酶０．５ Ｌ，引物浓度为１０／，ｍｏｌ／／，Ｌ。 ＰＣＲ条件：９５℃５ ｍｉｎ；９４℃４０ Ｓ，５８℃４０ Ｓ， ７２℃延伸１ ｍｉｎ ３５个循环；７２℃７ ｍｉｎ，４℃结束 反应。 菌类药物按常规Ｋ－Ｂ法进行试验。 ２结果 ２．１土壤中分离的枯草芽胞杆菌菌落及染色结果 通过稀释平板涂抹法从２３份土壤中分离得到 １７株芽胞杆菌。将其接种在普通营养琼脂培养基 ｌ＿２．４．２ ＰＣＲ反应产物的检测及序列测定ＰＣＲ 上，３７℃恒温培养２４ ｈ～４８ ｈ观察，在普通营养琼 脂平板上，菌落为圆形，边缘不规则，表面有皱襞。 挑取单个菌落涂片，可见革兰阳性、直杆状细菌，常 成对或呈链状排列，芽胞近中生。 ２．２分离株的生化鉴定 扩增产物在１０ ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶上以溴酚蓝作指示 剂于０．５×ＴＢＥ中１４０ Ｖ电压下电泳，结果于凝胶 成像系统观察拍照。同时回收ＰＣＲ产物送华大基 因工程公司测序，用ＤＮＡ Ｓｔａｒ分析测定序列与已 公布相应序列的同源性。 １．２．５ 耐酸性试验用０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣ１将普通液 体培养基ｐＨ分别调为１．５、２．５、３．５和４．５，１２１。Ｃ 对１７株菌株的细菌形态特征、革兰染色观察及 触酶、发酵葡萄糖、木糖、甘露醇、木糖、蔗糖等常规 生化试验，发现有１３株菌株的生化反应与枯草芽胞 杆菌基本一致。结果见表１。 表１ １３株分离株的生化鉴定 Ｔａｂｌｅ １ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １３ ｉｓｏｌａｔｅｓ 项目＼菌种Ｉｔｅｍｓ／ｓｔｒａｉｎｓ 革兰染色Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎ 触酶试验Ｃａｔａｌａｓｅ ｔｅｓｔ 阿拉伯糖Ａｒａｂｉｎｏｓｅ １ ＋ ＋ 十 ２ ＋ ＋ ＋ ３ ＋ ＋ ＋ ４ ＋ ＋ ＋ ５ ＋ ＋ ＋ ６ ＋ ＋ ＋ ７ ＋ ＋ 一 ８ ＋ ＋ ＋ ９ ＋ ＋ ＋ １Ｏ ＋ ＋ ＋ １１ ＋ ＋ ＋ １２ ＋ 一 ＋ 葡萄糖Ｇｌｕｃｏｓｅ 甘露醇Ｍａｎｎｉｔｏｌ 木糖Ｘｙｌｏｓｅ 蔗糖Ｓｕｃｒｏｓｅ ＶＰ试验ＶＰ ｔｅｓｔ 柠檬试验Ｌｅｍｏｎ ｔｅｓｔ ＋ 一 ＋ ＋ ＋ 一 ＋ 十 ＋ ＋ ＋ ＋ 十 十 ＋ ＋ ＋ ＋／一 ＋／一 十 ＋／一 十／一 一 ＋ ＋ 一 ＋ 一 ＋ ＋ ＋ 十 ＋ ＋ ＋ ＋／一 ＋ 一 ＋ ＋ 一 ＋ ＋ 十 ＋ ＋ 十／一 ＋ ＋ 十 ＋／一 一 ＋ ＋ 一 十 ＋ ＋／一 ＋ 一 一 ＋ ＋ 一 ＋ ＋ 一 ＋ ＋ 一 十／一 十／一 淀粉试验Ｓｔａｒｃｈ ｔｅｓｔ 明胶液化Ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎ ＋／一 ＋ 一 ＋／一 ＋ 一 一 ＋ ＋ ＋／一 ＋ ＋ ＋ ＋ 一 ＋ ＋ ＋ ＋／一 一 ＋ ＋／一 ＋／一 一 注：“十”表不阳性或能利用；“一”表不阴性或不能利用；“十／一”表不ｌ司一属具体不ｌ司菌株之间的细微差别。 Ｎｏｔｅｓ：“＋”ｍｅａｎｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｏｒ ｕｓａｂｌｅｎｅｓｓ；“一”ｍｅａｎｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｏｒ ｕｎｕｓａｂｌｅｎｅｓｓ；“＋／一”ｍｅａｎｓ ｔｈｅ ｓｕｂｔｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｓａｍｅ ｇｅｎｕｓ． ２．３分离株ＰＣＲ检测结果 于Ｑ１～Ｑ１０。ＰＣＲ产物于１０ ｇ／Ｌ的琼脂糖凝胶进 通过ＰＣＲ进一步鉴定，１３株分离菌株中有１Ｏ 行电泳分析，结果见图１。测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ已 个菌株中扩增到了大约４３９ ｂｐ基因片段，分别命名 公布的枯草芽胞杆菌（序列号：ＮＣ一０００９６４）特异性序 秦瑶等：土源枯草芽胞杆菌的分离鉴定及生物学特性研究 ４３ 列的同源性在９９ 以上。 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ Ｍ１２ ｌ３ １４ ｌ５ ４３９ Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ １ ２００；１～１０．枯草芽胞杆菌；１１．阳性对照；１２～ １５．阴性对照，依次为大肠埃希菌、沙门菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌 Ｍ．ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ １ ２００；１－１０．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｕｂｔｉｌｉｓ；１１．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎ— ｔｒｏＩ；１２—１５．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ，ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｓａｌｍｏ— ｎｅｌｌａ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，ｓｔａｐｈ ｌｏｃ０ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ￥ 图１ 分离株ＰＣＲ扩增结果 Ｆｉｇ．１ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ２．４耐酸能力检测结果 分离株具有在酸性环境中生长繁殖的能力，是 任何能在消化道中起作用的菌株所应具备的特 性［１ 。本试验测定了不同ｐＨ下，不同时间段内枯 草芽胞杆菌的活菌数。结果显示Ｑ１、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ８、 Ｑ９、Ｑ１０在ｐＨ为１．５时活菌数仍比较高，其余分离 株对酸性的耐受力则相对较弱（Ｑ４分离株结果见图 ２） 糟 矗 ｐＩ＇Ｉ 图２ Ｑ４分离株对不同ｐＨ酸的耐受结果 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｔｏｌｅｒａｂｌｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ Ｑ４ ｉｓｏｌａｔｅ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ２．５耐胆碱能力检测结果 测定了分离株在不同胆盐浓度下，不同时间段 内枯草芽胞杆菌的活菌数。结果显示，分离株对胆 盐的耐受性随着浓度与时间的推移而表现出有一定 的差异，其中Ｑ１、Ｑ２、Ｑ４、Ｑ８、Ｑ５、Ｑ１０的耐胆碱能 力较强，其中Ｑ４分离株结果见图３。 ２．６ 耐高温能力检测结果 对分离株进行４种温度的处理，结果显示，１Ｏ株 枯草芽胞杆菌对温度的敏感性不高，在１２１℃处理 ２０ ｒａｉｎ后仍存活，表明菌株可以很好的耐高温，与预 期结果相符。 囊 ０ ０ 矗 图３ Ｑ４分离株对不同浓度胆碱的耐受结果 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｔｏｌｅｒａｂｌｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ Ｑ４ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｔｏ ｃｈｏｌｉｎｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ２．７耐药性检测结果 对１０株分离株进行１Ｏ种抗菌药物的耐药性检 测（判定标准：抑菌圈直径大于２．０ ｃｍ为敏感， １．５ ｃｍ～２．０ ｃｍ为高敏感，１．０ ｃｍ～１．４ ｃｍ为中敏 感，小于１．０ ｃｍ为低敏感，０为不敏感）。其中７／１０ 分离株对红霉素不敏感，９／１０对单霉素不敏感，３／１０ 对青霉素不敏感，４／１０对甲氧苄啶不敏感，３／１０对 复方新诺明不敏感，对其余的抗菌药物均为低敏感。 ｌ０株分离株对抗菌药物的敏感性见表２。由表２ 知，１０株枯草芽胞杆菌对不同类的抗菌药物的敏感 性不同。 ３讨论 从采集的２３份土壤中分离获得１７株芽胞杆 菌，通过细菌形态特征、染色镜检观察及生化鉴定发 现其中有１３株菌株与枯草芽胞杆菌生化反应相似， 再通过特异性ＰＣＲ方法进行进一步鉴定，最后分离 得到１０株枯草芽胞杆菌，分别命名为Ｑ１～Ｑ１Ｏ。在 分离鉴定时，由于枯草芽胞杆菌与其他某些芽胞杆 菌细菌形态特征及其生理生化特性极其相似，因此 仅通过形态特征及其生理生化特性只能初步确定枯 草芽胞杆菌。为了更进一步确定还需从另外的角 度，如基于１６Ｓ ｒＲＮＡ特异性ＰＣＲ扩增的检测等多 种方法结合使用，可以更准确的判断相应的细菌［１ 。 食糜由胃进入小肠后开始小肠内的消化，小肠 内消化是整个消化过程中重要的阶段，也是各种益 生菌制剂发挥作用的场所。而胃液的ｐＨ约为０．９ ～１．５，益生菌只有经受住酸性条件，才能保持一定 数量的活菌数，进入小肠进一步发挥其作用；另外， 小肠中胆盐的高渗透压环境也不利于菌体存活，小 肠内胆盐浓度一般为０．３ ｇ／Ｌ～３．０ ｇ／Ｌ，其中 ３．０ ｇ／Ｌ的胆盐浓度被认为是筛选抗性菌的标准；同 时菌株的耐高温性能促使它在加工生产过程中可以 保持很好的活性，使其用于益生菌制剂的生产成为 可能ｒ１ 。而本试验结果表明Ｑ４、Ｑ１０等具有良好 ４４ 动物医学进展２０１４年第３５卷第１期（总第２４７期） 生物学特性的菌株在ｐＨ １．５时作用６ ｈ仍然可以 中国微生态学杂志，２００２，１４（５）：２７０—２７２． 具有较高的存活率，同时其在３．０ ｇ／Ｌ的胆盐水平 下作用作用４ ｈ与１．０、２．０、４．０ ｇ／Ｌ的胆盐水平相 比较细菌数量最多。除此之外，枯草芽胞杆菌对温 度的敏感性不高，分离鉴定的１Ｏ株菌株在１２１℃处 理２０ ｍｉｎ后仍可存活。对于枯草芽胞杆菌的药物 敏感性，有相关报道显示，其分离菌株对氨苄西林、 Ｅ３］姜文侠，史连生．饲用微生态制剂益生素［Ｊ］．动物科学与动 物医学，２０００，１７（２）：５７—６０． Ｅ４］戴青，赵述淼，谢树贵，等．一株凝结芽孢杆菌的分离筛选 及生物学特性研究［Ｊ］．饲料工业，２００８，２９（１２）：３６—３８． Ｅ５］郭小华，赵志丹．饲用益生芽孢杆菌的应用及其作用机理的 研究进展口］．中国畜牧兽医，２０１０，３７（２）：２７—３１． ｒ６］Ｒａｎ Ｃ，Ｃａｒｒｉａｓ Ａ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｍ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａ— ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃａｔｆｉｓｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ［Ｊ］． ＰＬｏＳ ０ｎｅ，２０１２：７（９）：ｅ４５７９３． 青霉素及诺氟沙星有很强的耐药性，对链霉素中度 敏感；而对试验中的其他抗生素高度敏感＿１引。本试 验通过对１Ｏ株枯草芽胞杆菌的生物学特性研究，筛 选出稳定性好、耐高温、耐胆盐、耐酸、耐药的菌株可 以补充肠道内源性益生菌的不足，从而提高益生菌 数量调节肠道菌群，改善机体抗病能力口 。有研究 报道表明，在幼龄大黄花鱼日粮中分别添加枯草芽 胞杆菌可以提高幼龄大黄花鱼的生长速度和饲料的 ｒ７］Ｌｅｅ Ｋ Ｗ，Ｌｉ Ｇ，Ｌｉｌｌｅｈｏｊ Ｈ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ—ｂａｓｅｄ ｄｉ— ｒｅｃｔ—ｆｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ ａｕｇｍｅｎｔ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎ ｂｒｏｉｌｅｒ ｃｈｉｃｋｅｎｓ［Ｊ］．Ｒｅｓ Ｖｅｔ Ｓｃｉ，２０１１，９１（３）：ｅ８７一ｅ９１． ［８３ 中国科学院南京土壤研究所．土壤微生物研究方法［Ｍ］．北 京：科学出版社，１９８５：２１—２３． ［９］ 东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［Ｍ］．北京：科学出 版社，２００１：４３—６５． ［１０］李雅丽，秦艳，周绪霞，等．６株芽孢杆菌的生物学特性比 较研究［Ｊ］．中国畜牧兽医，２０１１，３８（４）：６２—６５． ［１１］ Ｓｃｈｗｉｅｇｅｒ Ｆ，Ｔｅｂｂｅ Ｃ Ｃ．Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｕｔｉｌｉｚｅ ＰＣＲ—ｓｉｎ— ｇｌｅ—‘ｓｔｒａｎｄ—‘ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｆｏｒ １ ６ Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ—— 转化效率ｒ１ 。本试验通过生物学特性研究发现分 离鉴定的１０株菌株中Ｑ４、Ｑ１Ｏ具有良好的生物学 性能。而有研究则表明具有良好生物学特性的益生 ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏ— ｂｉｏｌ，１９９８，６４（１２）：４８７０—４８７６． 菌可制成微生态制剂，进入胃肠道后不会因正常消 化液而被杀灭，可转变成有活性的益生菌发挥其调 节胃肠道正常菌群的作用口引。 本研究为后续枯草芽胞杆菌的体外拮抗试验做 出了一定的铺垫，同时筛选出的具有良好生物学特 性的菌株也可以作为益生菌制剂的候选菌株加以开 发利用。 ［１２］高书锋，刘惠知，周映华，等．１株猪源肠道益生菌的分离鉴 定及其生物学特性研究［Ｊ］．畜牧与兽医，２０１２，４４（１）：１９— ２２． ［１３１林跃鑫，江胜滔，卢龙娣．一株益生芽孢菌株的分子鉴定及 其药敏分析［Ｊ］．龙岩学院学报，２０１１，２９（５）：３５—３８． ［１４］ 宁豫昌，赵绪永，郑鸣．猪源芽孢杆菌的分离鉴定及生物 学特性研究［Ｊ］．中国畜牧兽医，２０１２，３９（９）：６６—６８． Ｅ１５］Ａｉ Ｑ，Ｘｕ Ｈ，Ｍａｉ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａ— ｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｆｒｕｃｔｏ０ｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｄｉｓ— 参考文献： ［１］蒋正宇，周岩民，许毅，等．低聚木糖、益生菌及抗生素对 肉鸡肠道菌群和生产性能的影响［Ｊ］．家畜生态学报，２００５， ２６（２）：１１ １５． ｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｌａｒｇｅ ｙｅｌｌｏｗ ｃｒｏａｋｅｒ，Ｌａｒｉｍｉｃｈｔｈｙｓ ｃｒ０ｃ８口［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２０１１，３１７（Ｉ－４）：１５５—１６１． ［１６］冼琼珍，马春全，梁丽敏，等．猪源益生菌的分离筛选及部 分生物学特性研究［Ｊ］．动物医学进展，２００６，２７（２）：８６—８９． ｒ２］岳寿松，王世荣．微生态制剂对奶牛夏季产奶量的影响［Ｊ＿． 动物医学进展，２０１４，３５（１）：４５—４９ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 柴达木绒山羊皮肤毛囊周期性变化的研究 张 寿 ，马玉林 ，倪关英 ，李志华。，常 （１．青海大学农牧学院，青海西宁８１０００３；２．青海省海西州农牧局，青海海西８１７０００； ３．青海省海西州动物卫生监督所，青海海西８１７０００） 摘 要：对柴达木绒山羊皮肤及毛囊的组织学周期性变化进行了研究。结果表明，柴达木绒山羊表皮从 ４月份开始逐渐增厚，此时毛囊也开始伸长、重建，绒山羊毛囊７月～１１月份进入兴盛期；此后毛囊又逐渐变 短，１月～３月份为休止期。初级毛囊和次级毛囊的密度、深度和毛球宽度的最低值出现在１月～３月份，随 后的几个月各数值逐渐增加，初级毛囊在８月份达最高，而次级毛囊在９月份为最高，以后又逐月递减；Ｓ／Ｐ 值在１月份最低，而在９月份最高。柴达木绒山羊毛囊群结构以二元型和三元型为主，其中三元型毛囊群最 多，也有少量一元型和四元型毛囊群。 关键词：柴达木绒山羊；毛囊；周期性 中图分类号：￥８５２．１６３；￥８５８．２７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１４）０１—００４５—０５ 绒山羊以其独特的绒毛产品在动物生产中享有 重要的地位。绒毛是绒山羊皮肤的衍生物，山羊绒 的产量很大程度上取决于其体格的大小及皮肤次级 毛囊的组织形态结构，它与初级毛囊生成的粗毛共 达木盆地。对柴达木绒山羊皮肤毛囊尤其是皮肤毛 囊周期性变化方面的研究尚未见报道，鉴此，对柴达 木绒山羊毛囊各性状周期性变化特征进行了观测， 旨在阐明柴达木绒山羊被毛周期性生长的有关机 同组成绒山羊的被毛。国外对绒山羊毛囊的研究较 多＿１。］，国内已有内蒙古绒山羊和辽宁绒山羊皮肤毛 制，揭示影响柴达木绒山羊产绒量的内在的组织学 结构。 囊方面的研究报道［５ ］，表明绒山羊皮肤毛囊一年中 呈现周期性的变化。柴达木绒山羊是辽宁绒山羊与 柴达木山羊杂交培育成的青海省地方品种，具有耐 寒旱、耐粗饲、适应性强、体格大而匀称、产绒多、绒 １材料与方法 １．１ 材料 从青海省海西州选取柴达木绒山羊５只，连续 在１年周期内每个月的２３日～２４日从体侧部取约 ｌｃｍ 的皮肤样品，每次取样尽量靠近最初一次采 质好的特点，是我国的珍贵畜种，分布在青海省柴 收稿日期：２ｏ１３—０７—２０ 作者简介：张寿（１９６４一），男，青海西宁人，教授，主要从事高原动物低氧适应研究。＊通讯作者 Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ０ｎ ｏｆ Ｂａｃｄｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｆｒｏｍ Ｓｏｉｌ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ＱＩＮ Ｙａｏ，ＷＡＮＧ Ｗｅｉ，ＧＵＯ Ｂｉｎｇ—ｊｉａｏ，ＷＡＮＧ Ｘｉ—ｃｈｕ，ＺＨＯＵ Ｘｉａ，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ—ｌａｎ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ，８３２００３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ ａｉｍｅｄ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｃｈｏｏｓｅ ｔｈｅ ｇｏｏｄ ｔｒａｉｔｓ ｐｒｏｂｉｏｔ— ｉｃｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ．Ｕｓｉｎｇ ｐｏｕｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ，ｃｏｍｂｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏ— ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ １ ６ Ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉ— ｃａｔｉｏｎ。１０ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｂａｃｚｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ２３ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｉｄ—ｂｅａｒｉｎｇ。 ｂｉｌｅ—ｂｅａｒｉｎｇ，ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ—ｂｅａｒｉｎｇ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔｅｎｔ ａｓｓａｙｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｄｕｔｅｄ，ａｎｄ ｔＷＯ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｃｈｏｓｅｎ ａｓ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ １ ０ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ