地高辛核酸探针的制备及研究进展

EOS性炎症及气道高反应性(AHR)。目前已研制成功供人体

中国医药指南2008年9月第6卷第18期胞内Ca2+中流量通过各种途径增加,阻止Ca2+内流,有助于解除平滑肌的痉挛。Mg2+为天然的钙通道抑制剂,可代替Ca2+或竞争Ca2+载体系统从而阻止Ca2+内流,使平滑肌兴奋2收缩偶联脱偶联,起到松弛平滑肌的作用。另外,在综合治疗基础上加用果糖二磷酸钠[8](FDP)5～10mg,每日2次静滴,连续5～7d,总有效率接近100%,明显优于对照组(P<0.05);且治疗组停用FDP及平喘解痉药后,病情无反复,未见不良反应。此外,还有抗胆碱药、机械通气、中医药的治疗研究等治疗方法,本文就不阐述了。

综上所述,支气管哮喘的研究正在不断深入,随着新药和新的治疗方法在临床上的不断应用,儿童支气管哮喘防治的前景十分广阔,令人欣慰。参考文献:

[1]

使用的抗IL25抗体SC55700,正在进行临床验证[6]。2.3.3　抗IgE治疗。在变应原诱导的哮喘速发反应和迟反应机制中,lgE介导、T细胞依赖的炎症反应机制起了主要作用。目前已研制成功供人体使用的重组人单克隆抗IgE抗体E25

(rhuMAb2E25)。给轻度患者首次静注2mg/kgE225,即可降

低血IgE水平,经多次注射即可明显抑制(未消除)变应原诱导的哮喘速发和迟发反应,并改善哮喘症状且不良反应少[6]。2.3.4　其他免疫治疗。一是调节Thl/Th2型细胞之间的平衡是哮喘免疫治疗研究的另一个热点之一。动物实验发现,注射1～2次分支杆菌疫苗可使小鼠血IgE产生受到抑制,变应原诱导的IL25产生明显减少。另外,DNA免疫疗法,包括基因接种、DNA免疫刺激序列(ISS)免疫治疗等[6]虽处于动物研究阶段,但有其广阔的应用前景。二是新型免疫调节剂。一些医务工作者探讨了新型免疫调节剂卡介苗多糖核酸、麻疹疫苗、重组r干扰素、IL212及砷剂等在哮喘中的地位2.4　抗白三烯药物

[1]

中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.第三届全国哮喘学术会纪要[J].中华结核和呼吸杂志,2000,23(6):3272

328.

。

[2][3][4][5][6][7]

近年来,哮喘防治领域中的另一进步是有关白三烯受体拮抗剂和白三烯合成抑制剂的研究[7]。前者通过选择竞争性抑制LTD4和LTE4受体,削弱了白三烯所介导的作用;后者则通过抑制52脂氧化酶,阻断白三烯的合成。二者可用于哮喘的预防和长期治疗,适用于12岁以上儿童。2.4.1　齐留通　白三烯合成抑制剂,对哮喘的维持治疗有效,与中或高剂量的吸入或口服皮质激素联用,能更好地控制哮喘和阿司匹林诱导的哮喘的鼻部症状。用法:600mg,qid,注意监测肝脏毒性,本品能显著提高茶碱的血药浓度。2.4.2　扎鲁司特　白三烯受体拮抗剂。研究发现它可显著改善激素抵抗型哮喘患者的肺功能。本品与茶碱一起服用可能导致茶碱的血清浓度上升到危险水平[7]。本品可致出血,血清转氨酶活性增高。用法:200mgbid[3]。

2.5　其他治疗　文献报道,应用多巴胺、硫酸镁静脉点滴治疗

刘春涛,谢敏.几种新发现的与哮喘有关的细胞因子[J].

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哮喘,有效率大于90%。其机制是哮喘发作时,气道平滑肌细

综　　述

地高辛核酸探针的制备及研究进展

王易振

(重庆医药高等专科学校　400030)

　　摘　要:核酸分子杂交技术是分子生物学、临床医学研究的重要手段之一。目前非同位素核酸探针标记方法所用的配基及检

测手段繁多。且各具优缺点,其中尤以地高辛配基标记的核酸探针技术突出,其检测灵敏度可达同位素标记探针。具有灵敏、安全、简便、实用等优点,具有广阔的应用前景。

关键词:地高辛;核酸探针;标记技术中图分类号:Q524文献标志码:A文章编号:167128194(2008)182108202　　随着分子生物学研究的不断深入和发展,核酸分子杂交技

术作为一种基础医学、临床医学和分子生物学研究及检测的重

短、放射线污染、价格昂贵等缺陷,致各种非同位素标记核酸探

针及相应检测方法相继出现。近年来,国内外发展的生物素2

要手段,愈来愈受到人们的重视。核酸探针是一段有特定序列、具一定长度(15个至近千个核苷酸)的,带有合适标记物,并仅与特异靶分子反应的核酸片段。可以通过分子杂交来检查标本中是否存在互补序列。

以往的核酸杂交主要使用高比活放射性同位素标记的核酸探针以及放射自显影检测技术。由于放射性同位素半衰期亲合素标记检测体系虽已广泛应用于医学研究和临床诊断,但它存在两个明显的缺点,即普遍存在于原核和真核生物中的内源性生物素的干扰;链霉素亲合素非特异性结合提高了本底,降低了检测灵敏度[1]。而地高辛配基化脱氧尿嘧啶核苷(dig2oxigenin2dUTP)标记的核酸探针技术,是上世纪90年代才发展起来的一种新型非放射性探针标记技术。由于它具有较高

中国医药指南2008年9月第6卷第18期的灵敏度,又克服了放射性同位素标记技术的固有缺点,加上自身方法的不断改进,已日益显示出优越性和广泛的应用前景。本文就地高辛核酸探针的制备及研究进展作一综述。1　地高辛核酸探针的制备

地高辛是从植物中提取的甾体强心甙。多年来一直作为有效的强心甙药物而广泛应用于临床治疗中。近年来,国外利用其水解去糖产物地高辛配基(又称异羟基洋地黄毒甙配基)作为半抗原免疫动物以获得单克隆抗体。其抗体与其他任何类固醇类似物,如人体中的性激素无交叉反应。地高辛通过间臂连接到脱氧尿嘧啶三磷酸核苷酸(dUTP)上形成地高辛2112dUTP(Digoxigenin2112dUTP)[2]。并以此化学修饰物为底物,经不同的方法制备核酸探针。1.1　酶促法[3]　该法以Digoxigenin2112dUTP为底物,经酶促反应将Digoxigenin2112dUTP作为dTTP的结构类似物,掺入到DNA中,根据反应机制的不同,酶促法又分:1.1.1　缺口平移法　该法利用DNaseⅠ先在DNA双链上随机断裂(缺口),以产生游离的3′2羟基,然后利用DNA聚合酶

Ⅰ(polyⅠ)的5′→3′外切酶活性,在缺口的5′2磷酰基端移去一

个或多个碱基,同时该酶利用其5′→3′聚合酶活性在缺口的3′2羟基端催化掺入核苷酸,添补缺口。如果该反应中加入Digoxigenin2112dUTP,则新合成的DNA片段可被标记。从而得到一种均一比活性的核酸探针。此法的关键在于调整好DNaseⅠ的活性,从而产生合适数量的缺口,缺口太少不能有效掺入标记物,反之DNA片断太短而无法使用。1.1.2　寡核苷酸3,末端标记法　该法主要利用DNA末端转移酶将Digoxigenin2112dUTP直接加入到寡核苷酸3′末端上,进行3′末端标记。接上数个Digoxigenin2112dUTP分子尾巴。14～100个核苷酸长度的寡核苷酸探针或RNA探针均可用此法标记。1.1.3　随机引物法　随机序列的六脱氧核苷酸沿DNA的多个位点与热变性的单链模板杂交。这些寡核苷酸在随后的聚合反应中作为3′2羟基引物,在加入Klenow聚合酶和所有4种核苷酸(含Digoxigenin2112dUTP)后,探针合成开始,在Kle2now聚合酶催化下,加入的核苷酸底物沿5′→3′聚合延伸,生成高效标记的探针。该法一般可允许10ng～3μg范围内探针有效地标记。每20～25个核苷酸中带有一个Digoxigenin2112dUTP。标记效率高,且模板DNA片断的大小不影响标记结果。标记条件也没有缺口平移法那样高。1.2　光敏标记法[4]　长臂光敏地高辛标记法是近年来发展起来的用光化学法进行探针标记的新方法。该法将分离纯化得

到的待标记DNA配制成1.0μg/μL水溶液,再将长臂光敏地

高辛(0.5mg/支,由军事医学科学院放射医学科研所提供)避光开瓶,加灭菌蒸馏水0.5mL溶解。按1∶1比例与待标记DNA混合后插入冰模中,光标记灯与样品管液面距离10cm,光照标记30min,光照完成后溶液变为暗红色。用水补足体积至100μL即成。2　地高辛核酸探针的检测

地高辛核酸探针同互补序列杂交后,杂交信号可用多种方法进行检测。主要常用方法如下:2.1　酶偶联化学显色检测法　同地高辛抗体连接的碱性磷酸酶能分别以四氮唑蓝(NBT)、52溴242氯232吲哚磷酸盐(BCIP)为底物,经碱性磷酸酶水解后,底物呈蓝色,显示杂交信号。

辣根过氧化物酶同地高辛抗体偶联后,能分别以氢氧化二氨基联苯胺/H2O2及42氯212荼酚/H2O2为底物。前者为棕

109

色,后者为蓝色显示杂交结果。

因酶促反应具放大效应,故具较高检测灵敏度。2.2　酶偶联化学发光检测法　AKP有数个偶联化学发光检测体系,其中最灵敏、最广泛地得到应用的是以金刚烷基122二氧恶烷芳香磷酸酯(AMPPD)为底物的化学发光反应。AMPPD在AKP作用下,去磷酸化成为酚盐中间产物,该中间产物可分解为金刚烷酮和受激发态芳香酯。持续发射477nm可见光(>1h),用AMPPD经1h在感光底片上可获得低于1pg的灵敏度[5]。由于AKP在50～60℃温育1～2h不失酶活性,故为膜杂交和原位杂交的最佳选择之一。3　研究进展及展望3.1　地高辛配基2112dUTP的化学合成中连接臂的结构长短对核酸杂交检测灵敏度及标记效率均有影响。一般认为,连接臂长度(主要原子数)以7～11原子数为佳。连接臂太短存在空间位阻现象,致核酸探针标记无效。而连接臂超过11个原子后,其长度对检测极限的影响尚无一致结论,但连接臂应具一定长度,以保证检测试剂同地高辛结合。此外,尚需考虑连接臂在dUTP杂环上的修饰位置,一般应以不影响碱基配对时氢键的形成为原则。一般修饰在C25位上。连接臂最好含有双键,以减少连接臂的扭曲。3.2　探针标记方法虽然很多,但以光敏化学标记法和随机引物法为好。这些方法操作相对简单,且标记效率高。光敏化学标记法与酶学标记法相比,前者可省酶促反应,大大减少操作中苛刻条件,方法简便。具有快速、安全可靠、探针稳定、成本较低等优点。DNA或RNA、单链或双链核酸均可标记。此外,标记的核酸易于纯化。由于标记物标记后为红色,所以标记过程可被肉眼监测。3.3　光敏地高辛标记核酸探针,具有操作方便、特异性高、灵敏度高、低背景的特点,已标记的探针在4℃贮存可达2年之久,方便随时应用[6]。用光标记法将光敏地高辛标记到探针上,制成光敏地高辛2核酸探针,再与固定在硝酸膜上的靶核酸进行靶DNA分子杂交,使之与抗地高辛2碱性磷酸酶结合,最后可用不同的检测方式进行检测,发光检测和显色检测均可,灵敏度可达0.1～1pg。

地高辛标记核酸探针虽具有样品本底干扰小、保存期长、操作相对简单、应用范围广等优点,但仍存在一些缺点,如样品处理困难,灵敏度的要求仍不尽如人意。离临床快速简便、灵敏度高、重复性好、准确度高的要求尚有许多问题尚待克服和解决。相信在国内外广大科技工作者共同努力下,地高辛标记核酸探针技术在医学科学研究及临床疾病诊断中必将发挥越来越大的作用。参考文献:

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