免疫比浊法测定D-二聚体的临床实验评价

免疫比浊法测定D-二聚体的临床实验评价

第35卷第2期 2005年4月 温州医学院

JournalofWenzhouMedicalCollege ,,bl_35NO.2 Apr.2005

免疫比浊法测定D一二聚体的临床实验评价 郑美琴.李承.江明华

(温州医学院第二附属医院检验科,浙江温州325027) 与疆

[摘要]目的:对免疫比浊法定量测定D一二聚体的方法进行临床实验评价.方法:实验评价包括精密

度测定,线性测定,回收实验以及干扰实验.结果:该D一二聚体定量测定试剂线性测定良好(0～1050)

ng/ml(大于该值需用因子稀释液稀释后再做测定),在(200～1050)ng/ml之间精密度测定cV小于10;回

收率在96%～102%之间,平均98.1%;回归方程为Y=I.019X土17.08,r=0.9993;对胆红素,血红蛋白,

甘油三酯均具有较好的抗干扰能力,类风湿因子对该试验干扰较大.结论:该方法简便,快速,敏感,适 合临床使用.

[关键词]D一二聚体;免疫比浊法;方法学评价;精密度;线性;干扰

[中图分类号]R446.61[文献标识码]B[文章编号]1000—2138(2005)02—0157—03 血浆D一二聚体(D-Dimer,D-D)是经凝血因子xIIIa 作用形成交联的纤维蛋白在纤溶酶作用下所产生的一种 特异性降解产物,是反映凝血及纤溶系统活化的分子标

志物之一.当血管内血栓形成时产生大量交联纤维蛋 白,纤溶酶活性继发性增强,血浆D—D含量增高.因此, 检测血浆D.D含量对血栓性疾病的诊断及溶栓治疗监测 等有重要意义,也是鉴别原发性和继发性纤溶的良好指 标….目前,血浆D—D检测方法主要有胶乳凝集法,酶 联免疫吸附试验,胶体金免疫渗透试验及免疫比浊法 等.王学锋等l2认为免疫比浊法最佳,酶联免疫吸附试 验次之.本研究所用比浊法D—D试剂盒在临床上应用的 时问尚短,其特点及其应用的报道较少,因此,我们重 点对免疫比浊法检测血浆D?D进行了实验评价. 1材料和方法

1.1标本收集抽取受检者静脉血1.8ml,加入装有 109mmol/L枸橼酸钠0.2ml的塑料试管中,轻轻颠倒混 匀,3000r/min,离心10min,分离血浆待测. 注:若红细胞比积(HCT)明显异常,抗凝剂用量 应校正,校正公式如下:

抗凝剂的体积(m1)=1.85×1o×血量(m1)× (1O0-HCT) 1.2仪器和试剂

1.2.1仪器:BECKMANCOULTER公司的ACL6000血凝仪. 1.2.2试剂:INSTRUMENTATIONLABORATORY公司的D. 收稿日期:2004—09—17

作者简介:郑美琴(1971～),女,浙江衢县人,主管检验师. Dimer试剂盒,包括:定标液批号B30041,胶乳试剂批 号B30041,BUFFER批号B30041. I.3检测方法

1.3.1原理:以抗D—D单克隆抗体标记聚苯乙烯颗粒, 在此颗粒抗体集合物中加入受检血浆,如血浆中含D.D, 则发生凝集反应,通过检测浊度的增加,可计算血浆D—

D的含量.

1.3.2仪器校正和建立标准曲线:用标准液和试剂作 D—D定标测定,仪器自动倍比稀释的方法建立标准曲线. 在ACL6000上进行,当标本D—D浓度大于300ng/ml时 为阳性,否则视为阴性,浓度大于1050ng/ml时需稀 释后作进一步检测,结果等于仪器测定值乘以稀释倍 数.由于国内尚无此配套质控品,故每次试验时,将定 标液及已配制好的混合血浆当作标本同时进行测定与质 量控制. 1.4实验方法

1.4.1批内精密度测定:取已测高值标本,用低值混 合血浆稀释成低,中,高三个浓度,重复测定2o次.然 后分别计算平均值,标准差,变异系数.

1.4.2批间精密度测定:上述标本分装并于一4o.C保 存,用上述D一二聚体定量测定试剂分别进行测试,连 续测定20d,分别计算平均值,标准差,变异系数. 1.4.3回收率实验:取一个非溶血,黄疸,脂浊血浆标 本进行测定1o次,计算均值,然后在血浆中添加已知不 同浓度的标准物,最终浓度分别为278.41ng/ml,330.91 ng/ml,383.45ng/ml,488,45ng/ml时,再进行测定, 最后计算回收率. 一 l57—

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1.4.5线性测定:取一个高值标准物用因子稀释液进 行梯度稀释,然后对备浓度进行测定,将测定值与理论 值进行线性回归分析.

1.4.6干扰实验:用高,中,低三个浓度的血浆标本,

按浓度梯度分别添加胆红素,血红蛋白,甘油三酯,RF (类风湿因子)测定备干扰物对结果的影响.每个标本测 定三次求平均值作为加干扰物后的测定值,参照NCCLS 表1D-D检测的精密度实验结果

Tab.IResultsofprecisiontestofD—Dimerimmunoassay 中干扰试验评价标准l,该测定值在已知标本浓度的± 1.96sd范围内,视为无显着性干扰. 2结果

2.1精密度检查由于D_D的参考值范围为<300ng/ml, 故低值取此附近.实验结果见表1.

该试剂在精密度方面完全符合临床使用的要求,试 剂在高,中值范围内的CV%均在5%以内,低值也能达到 lo%以内,重复性性能表现良好.此外增加了一部分低 于200ng/ml的标本进行重复性测定,发现C,'大于1o%. 2.2回收率测定该试剂在各浓度段的回收率均大于 95%,平均为98.1%.非特异性结合的影响较少,使用上 可合乎临床上使用的要求.具体结果见表2. 表2D-D检测的回收率试验结果

Tab.2ResultsofreclamationtestofD—Dimerimmunoassay D-D最终浓度ng/ml回收率% 278.41 330.91 383.45 488.45 1O1.6 97.8 97.O 96.O

2.3线性测定D-D的正常参考值为(0~255ng/m1).

从实验结果可见,该试剂的线性测定范围为(o～1050) ng/ml,线性良好(Y=1.019X±17.o8,,=0.9993), 高于此值则用因子稀释液1:5,1:25,1:625等比例稀 释后重新测定,完全能满足临床的测定要求.线性测定 结果见图1.

2.4干扰实验D?D定量测定试剂在胆红素浓度为o～ 4.9mg/dl(83.79mol/L),血红蛋白浓度为o～5omg/ dL(500g/L),甘油三酯浓度为998.8mg/dl

(11.30mmol/L),RF<60IU/ml的干扰情况下,各浓度 范围的平均偏差均在±1.96sd以内,视为无显着干扰. 详细结果见表3. 3讨论 二 妄 三 趔 蘑

理论值lng/m1)

图1D—D试剂线性试验结果

Fig.1Resultoflinarityofd-dimerimmunoassay

D-D是交联纤维蛋白降解的特异性分子标志物,检测 血浆D?二聚体已成为判断血栓形成危险性直接而实用的 方法].然而,D一二聚体检测方法不同,在临床应用中存 在差异,十分有必要进行方法评价和广泛的临床应用. D-D测定方法主要有:胶乳凝集法,酶联免疫吸附 试验(ELISA法),胶体金免疫渗透试验法及免疫比浊法. 胶乳凝集法,是一种半定量的试剂盒,敏感度较低,只 能作为筛查.ELISA法的敏感性较好,是检测D-D的经 典方法,但是,它存在操作费时,复杂的不足,每次均

需同时做标准曲线,增加了操作成本,不适于单个标本 检验.然而对进行溶栓治疗的患者来说,作D-D浓度的 动态观察是十分必要的,所以需要尽快,逐个出结果, 随时调整治疗方案.可见ELIS~法在临床应用中还存在 缺陷.胶体金免疫渗透试验法虽然速度较快,但重复性 和准确性都不是很好,而且与ELISA法的结果相关性并 ～ 158～

第35卷郑美琴,等:免疫比浊法测定I卜二聚体的临床实验评价第2期 表3D-D检测的干扰试验结果

Tab.3Resu1tsofinterferenceofD—DimetimmunoaSsay 不好[81.临床上急需一种快速,简便,准确的D-D定量 测定方法,以便能及时准确地判断患者的病情. IL—TestD-Dimer定量测定试剂采用免疫比浊法,

其反应原理是以抗D—D单克隆抗体标记固相载体聚苯乙 烯颗粒,在此颗粒抗体集合物中加入受检血浆,如血浆 中含D-D,则与上述颗粒发生凝集反应,导致光产生散 射效应,从而引起反应系统中透光度的减低,在405nm 处比色并记录其变化,从标准曲线上读出结果,由此定 量测定出血浆中D-D的含量.该实验在ACL6000型以上 血凝仪上均可进行,使用方便,操作简单,为定量测定 试剂盒.本研究发现,该试剂在高,中值范围内的CV% 均在5%以内,低值(278.41ng/m1)也能达到1o%以 内,重复性性能表现良好;平均回收率达到98.1%;线 性良好(Y=1.019x±17.08,,=0.9993);另据文献 报道j,IL—TestD-Dimer与ELISA法具有相似的敏感 度及阴性预示值;而且整个测试时间只需10min,可用 于临床急诊需要,特别对深层静脉血栓,微细血管血栓

和肺梗死病症的提前诊断意义更大tS-Tj,另外也可作为 临床溶栓治疗的动态观测指标.

但是该方法也有其局限性:线性范围较窄(0～ 1050ng/m1),超出此范围必须用因子稀释液手工稀释 重新测定.本试验增加一部分D-D浓度在200ng/ml以 下的标本,测定结果显示cV值可达10~6以上,但由于 95%可信度范围是0~300ng/ml[sl,故对临床使用影响 不大.胶乳试剂的稳定期不够长,复溶后5d内较稳定, 1w以后测定结果c,可以达到20%以上.

RF对该试验的影响比较大.这是由于RF是一种变 性的IgG,与天然的IgG结合能力较差,但易与免疫复 合物中的IgG发生聚合反应,影响结果的准确性.因此 对RF阳性的患者应该对标本进行预处理,即:在RF阳 性标本中加入抗人IgG以中和RF,混匀后,置37.C水浴 中30min,离心取上清液,再测D—D含量,才能客观地 反映患者的实际情况[41.

综合上述实验分析结果,IL-TestD—Dimer是完全 定量,完全自动化,快速,方便的试验,特别是采用了 比浊法原理,使测定的特异性得到增强,在ACL6000以 上血凝仪上即可进行测定,完全能满足临床需要. 参考文献:

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