现代生物学技术在农兽药残留检测中的应用

ENVIRONMENTALSCIENCEANDMANAGEMENTVol134No111

Nov.2009

文章编号:1674-6139(2009)11-0125-04

现代生物学技术在农兽药残留检测中的应用

李兆华,王小虎,郑秀苹,尹济滨

(山东省环境保护科学研究设计院,山东济南250013)

摘 要:农药污染和兽药残留已构成对环境和人类健康的严重威胁,农产品的质量安全问题日益突出,迫切需

要开发简便、价廉、快速的农兽药残留快速检测技术。目前各种生物技术已广泛应用于残留快速检测领域,本文主要对免疫分析技术、分子印迹技术、酶活性抑制技术、生物传感器、生物芯片技术等现代生物技术的发展概况及其在农兽药残留检测中的应用进行了概述。并重点介绍了五种免疫分析技术的原理及应用。关键词:现代生物技术;药物残留;食品安全;免疫分析技术中图分类号:X503.22文献标识码:A

ApplicationoftheModernBiotechnologyontheDetectionp

ofPesticdeandVeterinaryDrugResidues

LiZhaohua,WangXiaohu,ZhengXiuping,YinJibin

(ShandongAcademyofEnvironmentalScience,Jinan250013,China)

Abstract:Thepolluentoftheresiduesofpesticdeandveterinarydrughavethreatedtheenvironmentandhumanhealth,thesafeofthequalityofagricultureproductswasseriousdayafterday,sotheconvenien,tcheepandfasttechnologyofdetectingresi2duesmustbedevelopedurgently.Thedevelopmentandtheapplicationonthedetectionofpesticdeandveterinarydrugresiduesofthemodernbiotechnologysuchasmimunoassays,molecularmiprintingtechnique,enzymeinhibition,biosensor,biochipwasre2viewed.Andthetheoryandapplicationoffivemimunoassayswereintroducedespecially.

Keywords:modernbiotechnology;drugresidues;foodsafty;mimunoassays

农业、畜牧业发展离不开农药、畜药,目前中国化肥、农药用量居世界之首。当今有机合成农药主要有:有机氯、有机磷、氨基甲酸脂、拟除虫菊脂等,常需检测其残留组分的约160多种。兽药典中规定要检测的兽药残留大致有:二苯乙烯及其衍生物、甲状腺抑制剂、类固醇、二羟基苯甲酸内脂、B2激动剂、磺胺类、喹诺酮类等。由于人们在使用中违规和失控,有毒农药污染和兽药残留已构成对环境和人类健康的严重威胁,农产品的质量安全问题日益突出。农兽药残留检测的传统方法是仪器检测法,它需要昂贵仪器、专业人员、检测周期长,不能满足社会对检测快速、及时的要求。快速检测方法具有省时、省力、省成本、能进行现场检测的优点。故颇需简便、价廉、快速的农兽药残留速测仪,这是带有中国特色的需求。生物技术是21世纪的主导技术,免

疫分析技术、分子印迹技术、酶活性抑制技术、生物传感器、生物芯片技术等现代生物技术将在食品安全快速检测领域得到广泛应用。

1 免疫分析技术简介

免疫分析主要是利用抗体能够与相应抗原及半抗原发生自发的、高选择性的特异性结合这一性质,通过将特定抗体(或抗原)作为选择性试剂来对相

[1]

应待测抗原(或抗体)进行分析测定的方法。农药、兽药等小分子物质残留免疫分析技术始于80年代后期,随着对小分子物质的免疫原性和半抗原研究的深入,这种学科交叉技术应用于农药残留分析将成为世界各国的学术研究和开发研究的新热[2-4]点。世界粮农组织已经向许多国家推荐此项技术,美国化学学会将免疫分析技术,色谱分析技术(气相和液相)共同列为农药残留分析的主要技术,其检测的结果具有法律效力。免疫分析法主要包括酶免疫分析法、放射免疫分析法、发光免疫测定、荧

#125#收稿日期:2009-04-02

作者简介:李兆华(1976-),男,工程师,研究方向为环境科学。

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光免疫分析、电化学免疫分析法等。其中酶免疫分

析法在农产品、食品安全检测中最为常用。1.1 酶联免疫吸附测定方法

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。ELISA的基本原理是使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持免疫活性,使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。

运用免疫学和生物工程技术所建立的酶联免疫吸附测定技术,在农兽药残留的快速检测和分析等食品安全性检测领域中得到了广泛应用。ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、成本低、简便快速、自动化程度高、检测方法多样和安全,方法操作简单,样品处理量大,检测范围在ng至pg水平,属于超微量分析技术等优势。国内外已研制出几十种农药的酶免疫检测试剂盒,包括有机磷、氨基甲酸酯类、硫代氨基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯类及酰胺类[5]

等。目前ELISA试剂盒已得到广泛应用,市场上针对农兽药检测的商品化试剂盒有许多,例如英国的Randox公司、德国R-Biopharm公司、意大利Tecna及美国Idexx公司的产品。1.2 放射免疫分析法

放射免疫分析(RIA)方法包括放射免疫分析和免疫放射分析,通过放射活性分子共价交联至抗体或抗原上,免疫反应后测定放射活性分子的放射信号来定量检测相应抗体或抗原等,可用于测定包括病毒、细菌、寄生虫、肿瘤以及小分子药物等的多种抗原和抗体。由于该方法特异性好,灵敏度高,且仪器自动化,操作简便,样品制备简单等,因而自50年代末问世以来已在许多领域中得到广泛的应用。但该方法中操作人员需要接触放射性物质,会损害操作人员的身体,同时测定完成后放射性材料的处置也是个严重的问题。1981年Ercegovich等首先建立了对硫磷的放射免疫分析方法,在人的血液和莴苣#126#叶片上它的检测限为10ng/mL~20ng/mL,检测水

[6]

中的残留量可达4ng/mL。

1.3 发光免疫测定

发光免疫测定(LIA)是将抗原与抗体特异性反应与敏感性的化学发光反应相结合而建立的一种免疫检测技术。它以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质标记抗体或抗原,当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后,发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用,发生氧化还原反应,反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光,最后用发光光度计进行检测。HRP标记的LIA常用的底物为鲁米诺或其衍生物,反应中产生的光强度低且持续时间短,因此常向反应体系中加入增强剂来增强发光和延长发光时间,所以反应又被称为增强发光酶免疫分析。由于具有超过放射免疫的高灵敏度,又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点,且测试中不使用有害的试剂,试剂保存期长等优点,已成为发光免疫学检测重要的发展方向。1.4 荧光免疫分析

利用一些有机化合物(例如荧光素)、荧光底物或稀土鳌合物等标记物的荧光免疫分析技术已广泛应用于微量、超微量物质分析测定。该技术包括竞争结合荧光免疫分析,免疫荧光分析,荧光偏振免疫分析和时间分辨荧光免疫分析。由于相对较低的灵敏度和需要相对昂贵的仪器,该方法在定量测定中的应用受到一定的限制。NataliaL.Pacioni等用荧光免疫技术检测西维因和克百威,其检测限为1415

[7]

ng/kg。1.5 电化学免疫分析法

电化学免疫分析法(ElectrochemicalImmunoas2say,ECIA)是将免疫技术与电化学检测技术相结合的一种免疫分析新方法。1951年Breyer和Radclif首次用极谱方法测定了由偶氮标记的抗原,这成为电化学免疫分析的开端。60、70年代后,电化学分析仪器及技术有了突破性的进展,可以用现代电化学技术测定小体积的样品中的痕量物质,同时由于电化学仪器固有的成本相对低廉,灵敏度高,易于微型化等特点,从而使得电化学免疫分析法在临床测定方面发展迅速。

从测定原理和应用上看,免疫分析的发展将存在两条并行的路线。一是免疫分析法继续在分析的可靠性和灵敏性上不断的革新、完善和进步,为生化研究和临床分析提供更为准确和实用的新方法;二是伴随现代生物技术的不断发展,免疫分析将渗透到各种全新的研究领域。

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2 分子印迹技术

分子印迹技术是上世纪九十年代兴起的一项新型材料技术,目前已经被广泛应用于各种难以分离

化合物的选择性分离和检测。分子印迹聚合物有三大特性:预定性、识别性和实用性。由于需要合成被印迹分子衍生物,使该项技术受到一些限制,因为有些化合物的分子无法进行衍生化。分子印迹聚合物的制备过程如下:首先,模板分子与功能单体通过共价键或非共价键结合产生功能团和空间结构互补的相互作用,形成配合物;第二,在过量交联剂的存在下,引发聚合,使模板分子-功能单体配合物周围发生聚合反应,形成高度交联的具有一定机械性能的高分子聚合物;第三,通过适当的方法除去模板分子,得到功能团和空间结构与模板分子互补的分子

[8]

印迹聚合物。

分子印迹溶胶-凝胶技术(MolecularImprintingSol-GelTechnique,MISGT)是一种理想的制备材料的方法,所合成的材料性能更加优良,兼顾了分子印迹和溶胶-凝胶二者的优点,克服了分子印迹有机聚合物的刚性与惰性较差的缺点,由于具有制备简单、性质稳定和对目标分子有高选择识别能力,已经成为一个重要的研究方向,在环境监测与分析、药物分析与分离、生物与临床医学等领域有着广泛的应

[9-10]

用前景。

结合在一起的装置,利用生物分子的催化作用或特

异性结合来检测物质,具有灵敏、快速、选择性高、一般不需对样品进行预处理、适合现场和在线监测等

[13]

优点。目前用于农药残留检测的生物传感器类型有:安培型电极,电位型电极,电压生物传感器和光纤生物传感器等。Vangelis等报道,采用光导纤维生物传感器分析了西维因与敌敌畏农药,它们的检测限分别为108Lg/L和512Lg/L,方法的准确

[15]

度为9419%。Abad等报道,采用压电晶体生物传感器测定有机磷和氨基甲酸酯类农药,检测是基于农药化合物对固定于石英晶体表面的乙酰胆碱酯酶活性的抑制效应,检测限范围为3mg/L~170

[16]

mg/L。

[14]

5 生物芯片技术

所谓生物芯片,就是一种能对生物分子进行快速并行处理和分析的薄型固体器件,它将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、尼龙膜等载体)的表面,组成密集二维分子排列,然后与待测生物样品中需要检测的物质分子(如某种药物、生物)发生反应,最后通过特定的仪器比如激光共焦扫描仪对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的检测分析,从而判断样品中对人类有害物质的数量。目前用于农兽药残留检测的生物芯片正处于发展的初期,可检测的农兽药种类相对较少,但初步实现了多残留检测,显示出生物芯片的并行性和高通量性,且生物芯片容易实现集成化和自动化,在农兽药残留的自动化检测上具有一定的优势。

在中国由于对残留危害的认识较晚,检测技术不够先进,残留检测体系还不够完善,农兽药在农产品及动物性产品中的残留现象严重。研制和开发高效、快速、适于普及和推广的检测方法和手段是控制农兽药残留的关键。就目前食品安全快速检测的发展来看,生物技术将得到广泛应用。其中,应用免疫学进行农兽药残留快速检测的研究非常活跃,尤其是酶联免疫分析技术取得了较大进展,而生物芯片技术和生物传感器技术则是主要的发展方向。

参考文献:

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[3]Mattiessen,P.,Fox,P.J.,Wood,A.B.Accumulationof

3 酶活性抑制技术

酶活性抑制技术(enzymeinhibition)是利用有

机磷、氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的活性抑制作用而建立起来的用于分析此类农药在食品中的残留量的技术。国内外已研制出多种方法,如速测卡法、速测片法、农药残留分光光度法、电化学生物传感器法。近年来,酶抑制技术进入了开发速测与应用的新阶段。李治祥1990年利用/BFS-2300型农药残毒速测箱0检测了蔬菜、水果、粮食中的有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留量,检出限分别在015mg/kg~10mg/kg、015mg/kg~10mg/kg、215mg/kg~1015mg/kg。近年来,中国自行研制的农药速测仪正向着体积小、重量轻、便携式、灵敏度高、重现性好、经济、简便、自动化程度高的方向发展

[11-12]

。

4 生物传感器

生物传感器是由分子识别元件(酶、抗体、受体、细胞及组织器管等)与信号转换器(电极、半导体、光导纤维、压电晶体及表面声波、热敏电阻等)

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(上接第124页)

(2)自动报警功能:当不正常状态出现时(如通讯事件、故障事件等)可以通过网络和手机短信等通讯手段将有关信息和指令发送给相关人员。

(3)数据存储功能:服务器接收到数据后,会对数据进行分析、筛选,剔除无效数据,以一定的数据结构存储到SQLServer2005数据库中。

(4)数据查询功能:系统采取基于浏览器/服务器模式的Brower/Server技术架构来搭建应用服务体系,用户采用统一的浏览器界面对所需查看的监测子站数据进行查询。

(5)数据统计功能:可以按照监测站点、监测因子、行政区等分类进行监测数据的各种统计,并可查看站点仪器工作状态,打印相应的统计报表。

(6)远程控制功能:中心站能通过传输网络对监测子站发送各种命令,如调取数据、修改参数、仪器控制等。

的,此系统可以对多个监测子站进行实时监测,通过GPRS网络将空气质量数据以一定的时间间隔传送给中心站,中心站也可以通过GPRS网络对监测子站进行仪器参数设置、远程控制等。GPRS技术的应用能增强上海市空气质量监测运行与管理的信息化和自动化,有利于提高数据传输的快速性、实时性和准确性,为空气质量日报发布和空气质量预报奠定良好的基础。

参考文献:

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3 结论

本文提出的空气质量自动监测系统是在充分考虑各监测子站现状、并结合信号传输的需要而提出

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