维普资讯 http://www.cqvip.com 微生物学通报 ２００２年２９（４） ． 桉树与联合固氮菌相互作用的研究 康丽华 （中国林业科学研究院热带林业研究所广州５１０５２０） 摘要：联合固氮菌一催娩克氏菌（ＫｌｅｂｓｉｅＵａ ９ｘｙｔｏｃａ ＮＧ１３Ｊ ｐＭＣ７３Ａ）接种木本植物桃金娘科 （Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）桉树属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）的苗木，研究它们之间相互作用关系。扫描电镜观察结果 表明：联合固氮菌不但可以在桉树根表定殖，而且还可进入根内定殖，并在接种桉树的根 际、根表和根内均分离到该菌。接种联合固氮菌能刺激桉树根系的分泌作用，并对根系分 泌物的氨基酸、糖及激素的含量有所影响。联合固氮菌对桉树生长有明显的促进作用。 关键词：桉树，联合固氮菌，相互作用 中图分类号：￥７１８．８３ 文献标识码：Ａ 文章编号：０２５３．２６５４（２００２）０４－００１４－０５ ＤｎＥ姒ＣｎＯＮ ＯＦ Ａ ；Ｉ＝＿Ｃ】ｒＡ ｒ、，Ｅ Ｎｎ ｏＧＥＮ－Ｆ１ Ａ 【ＯＮ ＢＡＣＩ１ ＲＩＡ砌Ｉ ＥＶＣＡｎ『】Ｐ１ｒＩ『ｓ ＫＡＮＧ Ｌｉ．Ｈｕａ （Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＴｒｏｐｉｃａｌ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｃｈｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ， ５１０５２０） Ａ 姗：Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｏ ｏｆ １￣２ｅｂｓｉｄｌａ∞ ＮＧ１３／ｐＭＣ７３Ａ ｔｈ Ｅｕｍ／ｙｐｔｕｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．１１ｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｅｖｅｎｔｈｅｉｎｎｅｒ ｃｏｒｔｅｘ ｏｆＥｕｃａ／ｙｐｔｕｓ ｗｅｒｅｃｏｌｏｎｉｚｅｄ ｂｙＫ．ｏｘｙＷｃａ．１１１ｅＫ．ｏｘｙＷｃａ ｗａｓｒｅｉｓｏｌａｔｄｅ ｆａｉｎ ｄａｉｚｏｓｐｈｅｒｅ．ｒｏｏｔ ｓｕｒｆｃａｅ ａｎｄ ｉＩｌｎＰｘ ｒｏｏｔ ｏｆｉｎｏｅｕｌａｔｅｄ Ｅｕｃａ／ｙ／ｍ￣． ｌ１ｌｅ ｉｎｏｃｕｌａ ０ｆｌ ｗｉｔｈ Ｋ．ｏｘｙＷｃａ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｃｏｄｙｐｔｕｓ ｒｏｏｔ ａｎｄ ａｆｆｅｃｔｄｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，ｐｈｙｔｏｈｏｎｎｏｎｅｓ ｏｆ ｒｏｏｔ ｅｘｕｄａｔｅｓ． １１１ｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｆ Ｅｕｃａｌｙｐａｚｔｏ ｔｏ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｏ ｗｉｈｔ Ｋ．ｏｘｙＷｃａ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｇｒｏｗｔｈ，ｔｏｔａｌ ｄｒｙ ｌｌｌａｔｔｅｒ ａｎｄ Ｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｂｙ ２９．８ｌ％～ｌ０ｏ．４０％ａｆｔｅｒ ３ ｎ￣ｎｔｈｓ ｉｎ ｃｏｒｎＤａ ｎｓ０ｎ ｔｏ ｔｈｅ ｕｎｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ． Ｋｅｙ ｗｏｎｂ：Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ 生物固氮在农、林业生产中起着重要作用，据报道，全球每年生物固氮的总量大 约为１亿吨，是工业氮肥的３倍多…。作为生物固氮的一个重要方面——联合固氮作用 日益引起重视。近２０年来，水稻、甘蔗、牧草等禾本科作物的联合固氮作用研究已有 大量报道，在根表糖基分布、植物凝集素、细菌胞外多糖及有关基因的克隆、鉴定与 机制等方面的研究取得较大进展 ，并逐步成为研究的前沿。但迄今为止对于联 合固氮体系的作用机理还有许多问题尚未阐明，为了使联合固氮作用获得更高的效益， 对植物和细菌的相互作用进行深人研究具有重要意义。近年来，联合固氮菌与水稻、 牧草等禾本科植物的相互作用研究较多，然而与木本植物相互作用的研究几乎没有。 桉树（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）是木本植物桃金娘科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）树种，是世界上３大速生树种 之一，也是我国华南地区的主要造林树种之一。目前，我国桉树人工林面积已超过１００ 万公顷，且每年新增５ １０万公顷。桉树是很好的纸浆原材料，在广东、广西和海南， 桉树造林已成为外商投资热点。桉树木片的出Ｅｌ为我国林业部门赚取了大量外汇，成 为林业行业支柱产业。目前，为提高桉树人工林产量，通常采用施用化学肥料的措施， ＊国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３９６７０６０５） ｅｃｔ Ｇｒａｎｔｄｅ ｂｙ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｕｎｄ（Ｎｏ．３％７０６０５） 国家“九五”攻关项目（Ｎｏ．９６－０１１－０１－０７－０１） 收稿日期：２００１４）４－１５，修回日期：２００１－０６－１１ 维普资讯 http://www.cqvip.com ２００２年２９（４） 微生物学通报 ・ １５ ・ 这不仅需要巨额投资，增加营林成本，且造成环境污染；长期经营桉树的林地土壤板 结，地力衰退，产量下降，这是实现桉树可持续发展的最大障碍。然而通过人工接种 联合固氮菌，将空气中约占７８．６％的分子态氮转化为可供桉树吸收利用的氨态氮，促 进桉树生长。这对于日趋贫瘠的桉树林地土壤改良、地力保持具有重要意义。本文研 究了联合固氮菌与桉树之间的相互作用关系，以便提高联合固氮作用效益。 １材料与方法 １．１菌种 联合固氮菌选用含有抗氨苄青霉素（Ａｐｒ）和卡那霉素（Ｋｍ ）质粒的催娩克氏菌 （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ ＮＧ１３／ｐＭＣ７３Ａ），来自广东省微生物研究所。 １．２菌的培养 在ＬＢ培养基中添加０．１ｇ氨苄青霉素（Ａｐ）／Ｌ和０．０５ｇ卡那霉素（Ｋｍ）／Ｌ，２８￣Ｃ ～３０￣Ｃ液体振荡（１ＯＯｒ／ｍｉｎ）培养２～３ｄ。 １．３桉树苗木的培育及接种方法 桉树树种采用尾叶桉（ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ），种子经０．１％ＨｇＣ１２表面消毒５ｍｉｎ，用 无菌水冲洗干净，播种于放有滤纸的无菌培养皿内，置于２８ｃＩ＝～３０ｃＩ＝培养箱，发芽后 移植到经１×１０５Ｐａ灭菌１ｈ的蛭石，沙为１：１的容器中，待苗木长至２ｃｍ～３ｃｍ时，用 无菌注射器吸取５ｍＬ菌液注射到苗木根系周围。培养３～４个月后取出苗木，进行显微 观察和测定桉树的高生长、生物量和Ｎ含量。 １．４扫描电镜观察 将接菌的桉树根在含０．８８％ＮａＣ１的磷酸盐缓冲液中洗涤数次，除去根表的杂质， 用ＪＦＣ一１ １００离子溅射度膜，ＪＳＭ一 ００扫描电镜观察。 １．５计数根际、根表及根内的催娩克氏菌 将接菌的桉树根分别经以下处理：（ａ）保留与根紧密结合的根际土，（ｂ）用含有 ０．８８％ＮａＣ１的磷酸盐缓冲液反复冲洗，除去根际土，（ｃ）将经过ｂ处理的根加２％Ｎａ— ＣＩＤ消毒３ｍｉｎ，再用无菌水冲洗。将经过上述不同处理的桉树根剪成０．３ｃｍ～０．５ｃｍ的 小段，于研钵中研磨成浆状，梯度稀释后涂在含有氨苄青霉素和卡那霉素的ＬＢ培养基 上，２８ｃＩ＝～３０￣（２培养２～３ｄ后计数，测定联合固氮菌在根际、根表及根内的定殖数量。 １．６桉树根系分泌物的收集 将经过３％盐酸浸泡１２ｈ、蒸馏水冲洗干净后烘干的河沙装入直径为３．５ｃｍ、高为 １９．５ｃｍ的玻璃大试管，加满Ｊｅｎｓｅｎ营养液，在１×１０５Ｐａ灭菌１ｈ。然后播种经过０．１％ ｎｇＣｌ￣表面消毒５ｍｉｎ并用无菌水冲洗干净的桉树种子。出苗后每支试管保留１株苗，接 种处理每株苗加ｌｍＬ的菌悬液，对照处理每株苗加ｌｍＬ的无菌培养液。每个处理４株 苗，３次重复。每周浇１～２次无菌水。培养３～４个月后取出桉树苗，称根系鲜重，每 个处理随机各取３０ｇ根系，用１Ｌ的无菌蒸馏水淋洗，收集液在６０ｃＩ＝减压浓缩至０．２Ｌ。 １．７桉树根系分泌物的测定 用氨基酸自动分析仪测定分泌物中氨基酸成分及含量。用分光光度计测定分泌物 中糖类的成分及含量。用酶联免疫法测定分泌物中激素的成分及含量Ｈｊ。 １．８桉树根系分泌物的添加及活菌数量测定 桉树根系分泌物经Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｉｎｉｓａｒｔ Ｎ ０．２ｔｕｎ过滤灭菌后加入已灭菌的含有氨苄青霉 维普资讯 http://www.cqvip.com ・ １６・ 微生物学通报 ２（Ｄ２年２９（４） 素和卡那霉素的ＬＲ液体培养基，使其浓度为５％、 １０％和２０％，接种联合固氮菌后振 荡培养３ｄ，用活菌计数法测定菌数。 ２结果与讨论 ２．１联合固氮菌在桉树根际的定殖部位 经扫描电镜观察，接种催娩克氏菌的桉树在根表皮、根毛区均可观察到大量的菌体，并 且在皮层薄壁细胞区也可观察到催娩克氏菌的存在（图１）。在未接种的对照桉树根表或薄 壁细胞中则看不到菌体存在（图２）。结果表明：催娩克氏菌不但可以在桉树根表定殖，而且 Ｏ ０ Ｏ Ｏ３ 啷 嘶 ７ ６ ４还可进入根内定殖。这与联合固氮菌在水稻等禾本科植物上的定殖部位相同＿６ 。 ０ Ｏ ０ ０蚴 图１接种的桉树根表皮细胞（２，ｏｏｏ×） 图２未接种的桉树根表皮细胞（２，ｏｏｏ×） ２．２联合固氮菌在桉树根际各部位的定殖情况 表ｌ桉树根际的催娩克氏菌数量 处理接种 对照用含有卡拉霉素和氨卞青霉素的选 择性培养基对桉树根际各部位定殖的催 娩克氏菌数量进行分析，菌数统计结果 表明：在根际土壤中催娩克氏菌数量最 根际（个幢土）根表（个，ｇ根）根内（个，ｇ根） ４．９×ｌｏ６ ０．０ ３．８×１０６ ０．０ １ ３×１ｏ５ ０．０ 多；其次为根表；根内数量最少（表１）。这与联合固氮菌在水稻、小麦等禾本科植物 根系的分布情况相一一致 ］。 表２桉树根系分泌物氨基酸成分及含量 ２．３联合固氮菌对桉树根系分泌物的影响 游离氨基酸 名称氨基酸含量（— ｇ鲜重根） 接种 对照（不接种） 天冬氨酸Ａｓｐ 谷氨酸Ｇｌｕ 丝氨酸Ｓｅｒ 甘氨酸Ｇｌｙ 苏氨酸Ｔｈｒ 组氨酸Ｈｉｓ 丙氨酸Ａｌａ 精氨酸Ａｒｇ 酪氨酸Ｔｖｒ 缬氨酸Ｖａｌ 蛋氨酸Ｍｅｔ 苯丙氨酸Ｐｉｌｅ 在水稻等禾本科植物与联合固氮菌的相互 作用研究中，发现了植物根所分泌的碳化物可 作为微生物的能源，而且有些分泌物还因为微 生物的存在而增加 ，分泌物中的有机酸和 糖对于根际微生物的生长、在根际的聚集、并 与根的联合固氮等是不可缺少的物质 。在未 接种固氮菌条件下，桉树根能分泌多种氨基酸、 糖类物质和激素，其中有些物质可能成为固氮 菌良好的碳源和氮源物质而被吸收利用，以支 持其在根际的生长。为此我们测定了在接种固 氮菌条件下桉树根系分泌物的组成和含量，结果 异亮氨酸Ⅱｅ 亮氨酸ｋｅｕ 赖氨酸Ｌｙ＊ 维普资讯 http://www.cqvip.com ２００２年２９（４） 微生物学通报 ・ １７・ 发现氨基酸、糖类和激素含量均发生变化（表２、３），其中除丙氨酸外的１４种氨基酸 和激素含量高于对照，糖类除了葡萄糖以外其余的蔗糖、果糖和多糖均低于对照，这 可能是定殖在桉树根际的催娩克氏菌选择性吸收利用蔗糖、果糖、多糖和丙氨酸以维 持其生长及代谢，同时释放出氨基酸和激素。 表３桉树根系分泌物糖类和激素成分及含量 ２．４桉树根系分泌物对联合固氮菌的影响 培养基添加根系分泌物对固氮菌生长的 表４不同浓度的桉树根系分泌物 影响结果表明：在根系分泌物浓度为２０％时， 对固氮菌生长的影响 固氮菌数量为３３３．３ Ｘ １０６个／ｍＬ，比对照提高 １７７．７５２％，随着浓度的降低，固氮菌数量随 之下降，当桉树根系分泌物浓度下降为５％ 时，其数量仅为１４７．０ Ｘ ｌｏ６个／ｍＬ，比对照提 高２２．５０％（表４）。说明桉树根际环境适合固 氮菌的生长。 ２．５接种联合固氮菌促进桉树生长的作用 联合固氮菌对桉树生长有明显的促进作用（表５），接种固氮菌的桉树在苗高、叶 片干重、茎干重、根干重和总生物量均高于不接种的对照。表６结果可以看出：桉树 接种固氮菌后，其叶片、茎、根和全植株的Ｎ含量明显高于不接种的对照。这可能是 桉树根际的催娩克氏菌固定空气中分子态Ｎ的结果。联合固氮菌与桉树之间的相互作 用研究结果，对桉树人工接种固氮菌提供指导，具有广阔的应用前景。 表５接种联合固氮菌对桉树苗木生长的效应 ＊Ｆ值为方差分析值，＊＊为接种与对照差异极显著（Ｐ≤０．０１） 表６接种联合固氮茵对桉树苗木Ｎ含量的影响（ｍｅ，ｔ￣） 维普资讯 http://www.cqvip.com ・ ｌ８－ 微生物学通报 ２Ｏ０２年２９（４） 参考文献 ［１］尤崇标，姜涌明，宋鸿遇主编．生物固氮．北京：科学出版社，１９８７．３２２ ３４７ ［２］林敏，尤崇标．核农学报，１９９３，７：９８～１０４． 燮．植物生理学通讯，１９８８，５：５３～５７． １３ Ｊ Ｂｒｏｃｋｗｅｌｌ Ｊ．Ａｐｐｈｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９６３，１１：３７７１～３３８３． ［４］吴颂如，陈婉芬，周［５］尤崇标，姜涌明，宋鸿遇主编．生物固氮．北京：科学出版社，１９８７．２２４ ２３５ ［６］Ｏｌｄ Ｋ Ｍ，Ｎｉｃｏｌｓｏｎ Ｔ Ｈ．Ｎｅｗ￣ｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，１９７５，７４：５１～５８． １７ Ｊ Ｍａｒｔｉｎ Ｊ Ｋ．Ｓｏｉｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７７，９：ｌ～７． ［８］Ｂａｒｂｅｒ Ｄ Ａ，Ｌｙｎｃｈ Ｊ Ｍ．Ｓｏｉｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｌ９７７，９：３０５—３０８． ［９］尤崇标主编．水稻根际联合固氮．北京：农业出版社，１９９０．２７３—２８３． ［１Ｏ］尤崇标主编．水稻根际联合固氮．北京：农业出版社，１９９０．２９４—２９７． 产过敏素ｈａｒｐｉｎ的固氮工程菌的某些特性研究 朱红惠 李艳琴 邱晓颖 丘明祺 赵立平 （山西大学生物工程开放实验室（广东省微生物研究所广州太原０３０ｏｏ６） ５ｌ０ｏ７０） 摘要：研究了产过敏素ｈａｒｐｉｎ的固氮工程菌（ 细 ６ｎ ｅｒ ｃ ∞∞ＦＡ）在番茄、烟草叶片上 的致过敏能力及该菌所携的双质粒的稳定性。试验结果表明：ＦＡ与Ｄ［－ＩＳ（ｐＣＰＰ４３０）致过 敏能力的速度和强度基本相同。Ｅ４与３０８Ｒ（ｐＣ￣４３０）相比，烟草上它们致过敏能力的速 度基本一致，但３０８Ｒ（ｐＣＰＰ４３０）致过敏能力的强度更强，在番茄叶片上，Ｅ４和３０８Ｒ （ｐＣＰＰ４３０）致过敏能力的速度和强度基本一样。Ｅ４所携的双质粒ｐＣＰＰ４３０和ｐＭＣ７３Ａ在宿 主细菌中是不稳定的，在宿主细菌连续繁殖过程中，质粒ｐＣＰＰ４３０和ｐＭＣ７３Ａ随宿主细菌 的繁殖而发生缺失，当连续传代４８代时，双质粒的丢失率达１００％，而且各含一种质粒的 细胞产生的机率基本相同。 关键词：Ｅ４，ｈ，ｐＮ基因，，矾基因，致过敏能力，质粒稳定性 中图分类号：Ｑ９３９．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：０２５３．２６５４（２ｏｏ２）０４－００１８－０５ ＳＴＵＤＹ ＯＮ ＴＨＥ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＳ ＯＦ ＡＮ ＨＡＲＰＩＮ－ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＢＡＣＩ＇ＥＲＩＡ ＳＴＲＡＩＮ ＴＯＬＥＲＡＮＴ ＴＯ ＡＭＭＯＮＩＵＭ ＡＮＤ ＮＩＴＲＯＧＥＮ－ＦＩＸＩＮＧ ＺＨＵ Ｈｏ￣－Ｈｍ’， ＬＩ Ｙａｎ－Ｑｉｎ’ＱｉＵ ｘｉａ０＿Ｙ ＱｉＵ Ｍｉ￣－ｆ， ＺＨＡＯ 一Ｐ Ｔａ／ｙｕａｎ ｏ３０ｏｏ６） （Ｓｈａｎ￣ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｈａｒ￣协Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ矿成咖由蝴Ａｌ￣ｒａｃｔ：Ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｈｙｐ￣ｉｔｙ ｏｎ ｌｅａｖｅｓ ｏｆｔｏｎ￣ｏ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆｄｏｕｂｌｅ－ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆａｎ ｈｍｐｉｎ－ｐｒｔＭｕｃ‘ ｉｎｓ，ｎｉｔｒｏｇｅｎ．ｆｉｘｉｎｇ嘶ｍ ｓｔｒａｉｎ ＦＡ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ．Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｅｘ￣ｉｔｍｍｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＦＡ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ＤＨ５，ｔｈｅ ｐｏｓｉｉｔｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐＣＰＰ４３０．Ａｌ ¨ｌ ＦＡ ｔｏｏｋｔｈｅ ｓ １ｌｅｌｉｍｅｔｏｉｎｄｕｃｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｉｔｖｉｔｙ ａｓ ３０８Ｒ。ａｎｏｔｈｅｒｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ￣ｐｃ２ｅ４３ｏ，ｉｔｉｎｄｕｃｅｄｗｅａｋ￣ｈｙｐｅｍｅｎ＿ ＊国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３９７７０５０９） ＰｒｏｊｅｃｔＧｒａｎｔｅｄ ｂｙ ｅｓｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｕｎｄ（Ｎｏ．３９７７Ｏ５０９） 山西省攻关资助项目（Ｎｏ．９９１０７３） 广东省自然科学基金资助项目（Ｎｏ．Ａ９９００１７） 收稿日期：２００１－０４－２０，修回日期：２００１－０５．２５
