维普资讯 http://www.cqvip.com 微生物学通报 2002年29(4) . 桉树与联合固氮菌相互作用的研究 康丽华 (中国林业科学研究院热带林业研究所广州510520) 摘要:联合固氮菌一催娩克氏菌(KlebsieUa 9xytoca NG13J pMC73A)接种木本植物桃金娘科 (Myrtaceae)桉树属(Eucalyptus)的苗木,研究它们之间相互作用关系。扫描电镜观察结果 表明:联合固氮菌不但可以在桉树根表定殖,而且还可进入根内定殖,并在接种桉树的根 际、根表和根内均分离到该菌。接种联合固氮菌能刺激桉树根系的分泌作用,并对根系分 泌物的氨基酸、糖及激素的含量有所影响。联合固氮菌对桉树生长有明显的促进作用。 关键词:桉树,联合固氮菌,相互作用 中图分类号:¥718.83 文献标识码:A 文章编号:0253.2654(2002)04-0014-05 DnE姒CnON OF A ;I=_C】rA r、,E Nn oGEN-F1 A 【ON BACI1 RIA砌I EVCAn『】P1rI『s KANG Li.Hua (Research Institute ofTropical Forestry,Chese Academy ofForestry, 510520) A 姗:The interactino of 1 ̄2ebsidla∞ NG13/pMC73A th Eum/yptus were studied.11he results showed that the root surface and eventheinner cortex ofEuca/yptus werecolonized byK.oxyWca.111eK.oxyWca wasreisolatde fain daizosphere.root surfcae and iIlnPx root ofinoeulated Euca/y/m ̄. l1le inocula 0fl with K.oxyWca stimulated the excretion of Eucodyptus root and affectde the contents of amino acids,carbohydrates,phytohonnones of root exudates. 111e seedlings of Eucalypazto to inoculatino wiht K.oxyWca increased growth,total dry lllatter and N content by 29.8l%~l0o.40%after 3 n ̄nths in cornDa ns0n to the uninoculated seedlings. Key wonb:Interaction,Eucalyptus,Klebsiella oxytoca 生物固氮在农、林业生产中起着重要作用,据报道,全球每年生物固氮的总量大 约为1亿吨,是工业氮肥的3倍多…。作为生物固氮的一个重要方面——联合固氮作用 日益引起重视。近20年来,水稻、甘蔗、牧草等禾本科作物的联合固氮作用研究已有 大量报道,在根表糖基分布、植物凝集素、细菌胞外多糖及有关基因的克隆、鉴定与 机制等方面的研究取得较大进展 ,并逐步成为研究的前沿。但迄今为止对于联 合固氮体系的作用机理还有许多问题尚未阐明,为了使联合固氮作用获得更高的效益, 对植物和细菌的相互作用进行深人研究具有重要意义。近年来,联合固氮菌与水稻、 牧草等禾本科植物的相互作用研究较多,然而与木本植物相互作用的研究几乎没有。 桉树(Eucalyptus)是木本植物桃金娘科(Myrtaceae)树种,是世界上3大速生树种 之一,也是我国华南地区的主要造林树种之一。目前,我国桉树人工林面积已超过100 万公顷,且每年新增5 10万公顷。桉树是很好的纸浆原材料,在广东、广西和海南, 桉树造林已成为外商投资热点。桉树木片的出El为我国林业部门赚取了大量外汇,成 为林业行业支柱产业。目前,为提高桉树人工林产量,通常采用施用化学肥料的措施, *国家自然科学基金资助项目(No.39670605) ect Grantde by Chinese National natural Science Fund(No.3%70605) 国家“九五”攻关项目(No.96-011-01-07-01) 收稿日期:20014)4-15,修回日期:2001-06-11 维普资讯 http://www.cqvip.com 2002年29(4) 微生物学通报 ・ 15 ・ 这不仅需要巨额投资,增加营林成本,且造成环境污染;长期经营桉树的林地土壤板 结,地力衰退,产量下降,这是实现桉树可持续发展的最大障碍。然而通过人工接种 联合固氮菌,将空气中约占78.6%的分子态氮转化为可供桉树吸收利用的氨态氮,促 进桉树生长。这对于日趋贫瘠的桉树林地土壤改良、地力保持具有重要意义。本文研 究了联合固氮菌与桉树之间的相互作用关系,以便提高联合固氮作用效益。 1材料与方法 1.1菌种 联合固氮菌选用含有抗氨苄青霉素(Apr)和卡那霉素(Km )质粒的催娩克氏菌 (Klebsiella oxytoca NG13/pMC73A),来自广东省微生物研究所。 1.2菌的培养 在LB培养基中添加0.1g氨苄青霉素(Ap)/L和0.05g卡那霉素(Km)/L,28 ̄C ~30 ̄C液体振荡(1OOr/min)培养2~3d。 1.3桉树苗木的培育及接种方法 桉树树种采用尾叶桉( urophylla),种子经0.1%HgC12表面消毒5min,用 无菌水冲洗干净,播种于放有滤纸的无菌培养皿内,置于28cI=~30cI=培养箱,发芽后 移植到经1×105Pa灭菌1h的蛭石,沙为1:1的容器中,待苗木长至2cm~3cm时,用 无菌注射器吸取5mL菌液注射到苗木根系周围。培养3~4个月后取出苗木,进行显微 观察和测定桉树的高生长、生物量和N含量。 1.4扫描电镜观察 将接菌的桉树根在含0.88%NaC1的磷酸盐缓冲液中洗涤数次,除去根表的杂质, 用JFC一1 100离子溅射度膜,JSM一 00扫描电镜观察。 1.5计数根际、根表及根内的催娩克氏菌 将接菌的桉树根分别经以下处理:(a)保留与根紧密结合的根际土,(b)用含有 0.88%NaC1的磷酸盐缓冲液反复冲洗,除去根际土,(c)将经过b处理的根加2%Na— CID消毒3min,再用无菌水冲洗。将经过上述不同处理的桉树根剪成0.3cm~0.5cm的 小段,于研钵中研磨成浆状,梯度稀释后涂在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养基 上,28cI=~30 ̄(2培养2~3d后计数,测定联合固氮菌在根际、根表及根内的定殖数量。 1.6桉树根系分泌物的收集 将经过3%盐酸浸泡12h、蒸馏水冲洗干净后烘干的河沙装入直径为3.5cm、高为 19.5cm的玻璃大试管,加满Jensen营养液,在1×105Pa灭菌1h。然后播种经过0.1% ngCl ̄表面消毒5min并用无菌水冲洗干净的桉树种子。出苗后每支试管保留1株苗,接 种处理每株苗加lmL的菌悬液,对照处理每株苗加lmL的无菌培养液。每个处理4株 苗,3次重复。每周浇1~2次无菌水。培养3~4个月后取出桉树苗,称根系鲜重,每 个处理随机各取30g根系,用1L的无菌蒸馏水淋洗,收集液在60cI=减压浓缩至0.2L。 1.7桉树根系分泌物的测定 用氨基酸自动分析仪测定分泌物中氨基酸成分及含量。用分光光度计测定分泌物 中糖类的成分及含量。用酶联免疫法测定分泌物中激素的成分及含量Hj。 1.8桉树根系分泌物的添加及活菌数量测定 桉树根系分泌物经Sartorius Minisart N 0.2tun过滤灭菌后加入已灭菌的含有氨苄青霉 维普资讯 http://www.cqvip.com ・ 16・ 微生物学通报 2(D2年29(4) 素和卡那霉素的LR液体培养基,使其浓度为5%、 10%和20%,接种联合固氮菌后振 荡培养3d,用活菌计数法测定菌数。 2结果与讨论 2.1联合固氮菌在桉树根际的定殖部位 经扫描电镜观察,接种催娩克氏菌的桉树在根表皮、根毛区均可观察到大量的菌体,并 且在皮层薄壁细胞区也可观察到催娩克氏菌的存在(图1)。在未接种的对照桉树根表或薄 壁细胞中则看不到菌体存在(图2)。结果表明:催娩克氏菌不但可以在桉树根表定殖,而且 O 0 O O3 啷 嘶 7 6 4还可进入根内定殖。这与联合固氮菌在水稻等禾本科植物上的定殖部位相同_6 。 0 O 0 0蚴 图1接种的桉树根表皮细胞(2,ooo×) 图2未接种的桉树根表皮细胞(2,ooo×) 2.2联合固氮菌在桉树根际各部位的定殖情况 表l桉树根际的催娩克氏菌数量 处理接种 对照用含有卡拉霉素和氨卞青霉素的选 择性培养基对桉树根际各部位定殖的催 娩克氏菌数量进行分析,菌数统计结果 表明:在根际土壤中催娩克氏菌数量最 根际(个幢土)根表(个,g根)根内(个,g根) 4.9×lo6 0.0 3.8×106 0.0 1 3×1o5 0.0 多;其次为根表;根内数量最少(表1)。这与联合固氮菌在水稻、小麦等禾本科植物 根系的分布情况相一一致 ]。 表2桉树根系分泌物氨基酸成分及含量 2.3联合固氮菌对桉树根系分泌物的影响 游离氨基酸 名称氨基酸含量(— g鲜重根) 接种 对照(不接种) 天冬氨酸Asp 谷氨酸Glu 丝氨酸Ser 甘氨酸Gly 苏氨酸Thr 组氨酸His 丙氨酸Ala 精氨酸Arg 酪氨酸Tvr 缬氨酸Val 蛋氨酸Met 苯丙氨酸Pile 在水稻等禾本科植物与联合固氮菌的相互 作用研究中,发现了植物根所分泌的碳化物可 作为微生物的能源,而且有些分泌物还因为微 生物的存在而增加 ,分泌物中的有机酸和 糖对于根际微生物的生长、在根际的聚集、并 与根的联合固氮等是不可缺少的物质 。在未 接种固氮菌条件下,桉树根能分泌多种氨基酸、 糖类物质和激素,其中有些物质可能成为固氮 菌良好的碳源和氮源物质而被吸收利用,以支 持其在根际的生长。为此我们测定了在接种固 氮菌条件下桉树根系分泌物的组成和含量,结果 异亮氨酸Ⅱe 亮氨酸keu 赖氨酸Ly* 维普资讯 http://www.cqvip.com 2002年29(4) 微生物学通报 ・ 17・ 发现氨基酸、糖类和激素含量均发生变化(表2、3),其中除丙氨酸外的14种氨基酸 和激素含量高于对照,糖类除了葡萄糖以外其余的蔗糖、果糖和多糖均低于对照,这 可能是定殖在桉树根际的催娩克氏菌选择性吸收利用蔗糖、果糖、多糖和丙氨酸以维 持其生长及代谢,同时释放出氨基酸和激素。 表3桉树根系分泌物糖类和激素成分及含量 2.4桉树根系分泌物对联合固氮菌的影响 培养基添加根系分泌物对固氮菌生长的 表4不同浓度的桉树根系分泌物 影响结果表明:在根系分泌物浓度为20%时, 对固氮菌生长的影响 固氮菌数量为333.3 X 106个/mL,比对照提高 177.752%,随着浓度的降低,固氮菌数量随 之下降,当桉树根系分泌物浓度下降为5% 时,其数量仅为147.0 X lo6个/mL,比对照提 高22.50%(表4)。说明桉树根际环境适合固 氮菌的生长。 2.5接种联合固氮菌促进桉树生长的作用 联合固氮菌对桉树生长有明显的促进作用(表5),接种固氮菌的桉树在苗高、叶 片干重、茎干重、根干重和总生物量均高于不接种的对照。表6结果可以看出:桉树 接种固氮菌后,其叶片、茎、根和全植株的N含量明显高于不接种的对照。这可能是 桉树根际的催娩克氏菌固定空气中分子态N的结果。联合固氮菌与桉树之间的相互作 用研究结果,对桉树人工接种固氮菌提供指导,具有广阔的应用前景。 表5接种联合固氮菌对桉树苗木生长的效应 *F值为方差分析值,**为接种与对照差异极显著(P≤0.01) 表6接种联合固氮茵对桉树苗木N含量的影响(me,t ̄) 维普资讯 http://www.cqvip.com ・ l8- 微生物学通报 2O02年29(4) 参考文献 [1]尤崇标,姜涌明,宋鸿遇主编.生物固氮.北京:科学出版社,1987.322 347 [2]林敏,尤崇标.核农学报,1993,7:98~104. 燮.植物生理学通讯,1988,5:53~57. 13 J Brockwell J.Apphed Microbiology,1963,11:3771~3383. [4]吴颂如,陈婉芬,周[5]尤崇标,姜涌明,宋鸿遇主编.生物固氮.北京:科学出版社,1987.224 235 [6]Old K M,Nicolson T H.New ̄ytologist,1975,74:51~58. 17 J Martin J K.Soil Biology Biochemistry,1977,9:l~7. [8]Barber D A,Lynch J M.Soil Biology Biochemistry,l977,9:305—308. [9]尤崇标主编.水稻根际联合固氮.北京:农业出版社,1990.273—283. [1O]尤崇标主编.水稻根际联合固氮.北京:农业出版社,1990.294—297. 产过敏素harpin的固氮工程菌的某些特性研究 朱红惠 李艳琴 邱晓颖 丘明祺 赵立平 (山西大学生物工程开放实验室(广东省微生物研究所广州太原030oo6) 5l0o70) 摘要:研究了产过敏素harpin的固氮工程菌( 细 6n er c ∞∞FA)在番茄、烟草叶片上 的致过敏能力及该菌所携的双质粒的稳定性。试验结果表明:FA与D[-IS(pCPP430)致过 敏能力的速度和强度基本相同。E4与308R(pC ̄430)相比,烟草上它们致过敏能力的速 度基本一致,但308R(pCPP430)致过敏能力的强度更强,在番茄叶片上,E4和308R (pCPP430)致过敏能力的速度和强度基本一样。E4所携的双质粒pCPP430和pMC73A在宿 主细菌中是不稳定的,在宿主细菌连续繁殖过程中,质粒pCPP430和pMC73A随宿主细菌 的繁殖而发生缺失,当连续传代48代时,双质粒的丢失率达100%,而且各含一种质粒的 细胞产生的机率基本相同。 关键词:E4,h,pN基因,,矾基因,致过敏能力,质粒稳定性 中图分类号:Q939.5 文献标识码:A 文章编号:0253.2654(2oo2)04-0018-05 STUDY ON THE CHARACTERS OF AN HARPIN-PRODUCING BACI'ERIA STRAIN TOLERANT TO AMMONIUM AND NITROGEN-FIXING ZHU Ho ̄-Hm’, LI Yan-Qin’QiU xia0_Y QiU Mi ̄-f, ZHAO 一P Ta/yuan o30oo6) (Shan ̄UniversityShar ̄协Laboratory矿成咖由蝴Al ̄ract:The ability to induce hyp ̄ity on leaves ofton ̄o and the stability ofdouble-plasmid ofan hmpin-prtMuc‘ ins,nitrogen.fixing嘶m strain FA were tested.Hypersensitivity-inducing ex ̄itmmt indicated that the time and density of hypersensitivity.induction of FA was similar to those of DH5,the posiitve control of pCPP430.Al ¨l FA tookthe s 1lelimetoinduce hypersensiitvity as 308R。anotherpositive control ̄pc2e43o,itinducedweak ̄hypemen_ *国家自然科学基金资助项目(No.39770509) ProjectGranted by ese National Natural Science Fund(No.3977O509) 山西省攻关资助项目(No.991073) 广东省自然科学基金资助项目(No.A990017) 收稿日期:2001-04-20,修回日期:2001-05.25