一株耐酸酿酒酵母菌及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112300950 A(43)申请公布日 2021.02.02

(21)申请号 2019107119.4(22)申请日 2019.08.02(83)生物保藏信息

CGMCC No.15315 2018.01.25

(71)申请人 内蒙古优然牧业有限责任公司

地址 010070 内蒙古自治区呼和浩特市赛

罕区河西路13公里北169号(72)发明人 刘倩　李颖丽　刘锋　李晓辉　

霍博　孙晓智　(74)专利代理机构 北京正理专利代理有限公司

11257

代理人 赵晓丹(51)Int.Cl.

C12N 1/18(2006.01)A23K 10/12(2016.01)

()发明名称

一株耐酸酿酒酵母菌及其应用(57)摘要

本发明公开了一株耐酸酿酒酵母菌及其应用。该耐酸酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)YR201705，其保藏编号为CGMCC No.15315。本发明还提供了该保藏菌株在发酵TMR中的应用。本发明所述耐酸酿酒酵母菌可以在pH 2.5酸度环境下生长，在pH 4.0酸度条件下大量快速生长繁殖，该酿酒酵母菌株在马铃薯葡萄糖培养基上生长，产生米酒香气的气味。在发酵TMR的高酸度环境下可显著改善发酵饲料的适口性。

C12R 1/865(2006.01)

权利要求书1页 说明书7页序列表1页 附图1页

CN 112300950 ACN 112300950 A

权　利　要　求　书

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1.一株耐酸酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)YR201705，其保藏编号为CGMCC No.15315。

2.权利要求1所述的耐酸酿酒酵母菌YR201705在发酵TMR中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：(1)按TMR总重量5％的添加量，在TMR饲料中添加权利要求1所述的耐酸酿酒酵母菌的菌悬液；

(2)按TMR总重量5％的添加量，在TMR饲料中添加糖蜜；

(3)将添加了耐酸酿酒酵母菌和糖蜜的TMR的水分含量调节至45％～55％；(4)有氧发酵；

(5)有氧发酵结束后，每千克发酵料中加入植物乳酸菌1.0×108个以上；(6)真空密封后贮藏，得发酵TMR。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述耐酸酿酒酵母菌的菌悬液中的菌数为4×1011CFU/ml-8×1011CFU/ml。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，有氧发酵的条件为：温度18℃-40℃，时间0.1-24小时。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，有氧发酵过程中进行翻料。7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(6)中，密封贮藏的温度为18℃-40℃，时间为2-21天。

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说　明　书

一株耐酸酿酒酵母菌及其应用

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技术领域

[0001]本发明涉及微生物发酵和饲料加工领域，具体涉及一株耐酸酿酒酵母菌及其在发酵TMR中的应用。

背景技术

[0002]近些年随着饲料工业的发展，全混合日粮(total mixed rations，TMR)技术已经成为当今国内外规范化、集约化等大型奶牛养殖场优选的饲养技术。因TMR可较好的混合饲草、谷物、蛋白类饲料、矿物质和饲料添加剂，可以满足动物自身的营养需求，因此，TMR可以显著提高料肉比，增加产奶量以及品质，还能有效降低相关疾病的发病率，在奶牛行业是一种较为理想化的饲料模型。但普通TMR是一种易变质类饲料，需要注意使用时间和保存时间，又由于劳动力的成本问题而了它使用的广泛程度。TMR在储存运输方面极易好氧变质，不仅导致营养流失，甚至会给奶牛带来某些疾病。而有效解决此类问题的途径就是使用发酵TMR。

[0003]发酵TMR是采用拉伸膜裹包或袋装等青贮技术将调制好的TMR饲料进行一段时间的密封贮藏，经过乳酸发酵调制而成的全价发酵饲料。其制作原理来自于青贮原理，即在非严格厌氧条件下，使饲料原料上的乳酸菌大量生长繁殖，将原料中的可溶性碳水化合物变成乳酸，达到一定浓度时，抑制有害微生物的生长繁殖，从而达到保存饲料的目的。发酵TMR在有效保持TMR日粮营养价值的基础上，通过发酵显著提高了TMR贮藏性和有氧稳定性，便于实现TMR的商品化和流通。

[0004]酵母菌是一种兼性厌氧型单细胞真菌，酵母菌菌体内富含多种营养物质,如蛋白质、B族维生素、脂肪和糖等。酵母具有瘤胃内环境、缓解瘤胃酸中毒、刺激纤维分解菌生长活性的能力，同时对瘤胃甲烷的产生及氮、氢代谢都具有重要作用，同时酵母发酵产生的特殊风味，能改善饲料的适口行。

[0005]发酵TMR的制作过程中pH值一般随乳酸等酸性物质的产生和积累，呈现不断下降的趋势。酿酒酵母作为发酵生产中的主要菌群，通常在整个发酵过程中的前期，对乙醇的生产能力较强，但随着发酵过程的进行，在酸度下降至pH≤4.5后，酵母菌的生理代谢活动逐渐受到抑制，甚至停止。因此，筛选能够在发酵TMR生产后期的高酸度环境条件下，仍具有旺盛代谢活动。较强乙醇发酵生产能力的耐酸酿酒酵母菌群，是发酵TMR工艺生产过程中，提高发酵品质的技术关键。

发明内容

[0006]本发明的目的是提供一株耐酸酿酒酵母菌，其适用于发酵TMR生产后期的高酸度环境，且制备的发酵TMR具有较好的适口性。[0007]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

[0008]本发明提供一株耐酸酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，菌名为YR201705，分类名为：酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae，已于2018年1月25日保藏于

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中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC No.15315。[0009]本发明耐酸酿酒酵母菌YR201705，是在添加酿酒酵母发酵TMR实验中，在发酵产酸pH4.0的条件下，筛选出能够生长繁殖的耐酸酿酒酵母菌。该耐酸酿酒酵母菌为兼性厌氧性真菌，耐酸性强(在pH 2.5酸度环境下可生长，在pH 4.0酸度条件下可大量快速繁殖)，生长速度快(MEB培养基培养18小时菌落总数可达9.0×1011cfu/ml)。与其它生物的情况一样，本发明耐酸酿酒酵母菌仍然易发生变异。因此，可以利用本领域已知的物理和化学诱变方法得到该菌株的突变株。这些突变株，只要保留了酿酒酵母菌耐酸能力这样一个特征，也属于本发明的一部分。

[0010]本发明耐酸酿酒酵母菌的获得方法是：将用MEB培养基富集培养的酿酒酵母菌添加到已添加乳酸菌发酵剂的TMR饲料中，进行真空密封打包，于室温条件下进行发酵。分别在发酵的第24h、48h、72h、5d、7d、10d、15d、20d、30d、40d、50d、60d采集发酵TMR样品进行pH及酵母总数测定。无菌条件下，取25g发酵TMR于无菌均质袋内，再加入225ml灭菌蒸馏水振荡混匀，使其终浓度为0.1g/ml，然后再吸取稀释后样品1ml加入含9ml灭菌蒸馏水的试管中振荡混匀，使其终浓度为0.01g/ml，按上述方法如此反复稀释至时宜稀释度后，吸取1ml于马铃薯葡萄糖平板，用无菌涂布器进行涂布后，置于28℃恒温培养箱中培养5d后计数。在发酵第20d之后，TMR样品的pH下降在4.2左右，只有在2个样品中检测到有酵母菌。在生长有酵母菌的平板上，用接种环挑取单菌落接种至麦芽汁肉汤培养基，置于28℃振荡培养箱培养18h后，用接种环挑取菌液划线于马铃薯葡萄糖培养基平板于28℃恒温培养进行培养，如此反复分离纯化3次后，将纯化的麦芽汁菌液划线于马铃薯葡萄糖斜面培养基，置4℃冰箱中保存。其中马铃薯葡萄糖培养基为：马铃薯浸取液(取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液不足至1.0L)1.0L；葡萄糖20.0g；琼脂15.0g；氯霉素0.1g，121℃，灭菌20min。麦芽汁培养基为：12Brix.麦芽汁1.0L，121℃，灭菌20min。[0011]在发酵的低pH值环境中，由于自发突变和自然选择作用，会产生和存在耐酸酿酒酵母菌株。根据TMR发酵过程中，酵母菌的低pH生活环境的酸度，配制酸度呈梯度差异的麦芽汁培养基，将保存于马铃薯葡萄糖斜面培养基的耐酸酿酒酵母菌株进行培养，做进一步筛选并对其耐酸性能进行测定。酸性麦芽汁选择培养基的制备方法：按常规方法制备麦芽汁培养基后，在无菌条件下，用乳酸调节培养基酸度，形成酸度分别为：pH 2.0～4.0的酸性梯度麦芽汁选择培养基。利用Ezup柱式酵母基因组提取试剂盒提取酵母菌基因组DNA，然后运用PCR扩增引物NL1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，如序列表中SEQ ID No.1所示)和NL4(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’，如序列表中SEQ ID No.2所示)，扩增出26S rDNA D1/D2区序列，在NCBI上比对相关序列，确定其菌种。最后将筛选出的菌株及对照菌分别添加到发酵TMR中，并将其于常温环境下发酵，开封后分析发酵后TMR品质并进行对比，确定该耐酸酿酒酵母菌可以提高常温环境下发酵饲料的发酵品质。

[0012]本发明还要保护上述耐酸酿酒酵母菌YR201705在发酵TMR中的应用。[0013]本发明的耐酸酿酒酵母菌YR201705可以用于调制发酵TMR饲料，具体方法包括如下步骤：[0014](1)按TMR总重量5％的添加量，在TMR饲料中添加权利要求1所述的耐酸酿酒酵母菌的菌悬液；

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(2)按TMR总重量5％的添加量，在TMR饲料中添加糖蜜；

[0016](3)将添加了耐酸酿酒酵母菌和糖蜜的TMR的水分含量调节至45％～55％；[0017](4)有氧发酵；[0018](5)有氧发酵结束后，每千克发酵料中加入植物乳酸菌1.0×108个以上；[0019](6)真空密封后贮藏，得发酵TMR。[0020]可选的，步骤(1)中，所述耐酸酿酒酵母菌的菌悬液中的菌数为4×1011CFU/ml-8×1011CFU/ml。

[0021]可选的，步骤(4)中，有氧发酵的条件为：温度为18℃-40℃，时间0.1-24小时。[0022]可选的，有氧发酵过程中进行翻料。[0023]可选的，步骤(6)中，密封贮藏的温度为18℃-40℃，时间为2-21天。[0024]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：[0025](1)本发明的耐酸酵母菌株可以改善TMR饲料的发酵品质，成本低、安全、可靠。[0026](2)发酵后的TMR易于长时间保存，便于运输。[0027](3)本发明的酿酒酵母菌株在马铃薯葡萄糖培养基上生长，产生米酒香气的气味。在发酵TMR的高酸度环境下可显著改善发酵饲料的适口性。附图说明

[0028]图1耐酸酵母菌的菌体形态图。[0029]图2 28℃、pH 4.0条件下，耐酸酿酒酵母菌生长曲线。

具体实施方式

[0030]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但并不是限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。[0031]实施例1筛选耐酸酿酒酵母菌[0032]从发酵第20天、pH4.2的TMR饲料中分离出酵母菌株2株，进行菌落形态观察和细胞形态观察，并根据生育pH(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)实验筛选出耐酸及生长速度快的酵母菌。结果表明，耐酸酵母菌细胞形态为球形或卵形，菌落乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐(见图1)。在pH 2.5条件下可生长，在pH 4.0条件下可快速大量生长(见图2)，具有较强的耐酸性。能发酵葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，不能发酵乳糖。采用形态学、生理生化和26S rDNA序列分析等分类法对降解菌株进行分类鉴定

[0033]耐酸酵母菌的生理生化试验：发酵类型及形态观察参照英巴尼特主编(胡瑞卿译)的《酵母菌的特征与鉴定手册》。

[0034]培养基及其配制的方法如下所述:[0035](1)马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯浸取液(取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液不足至1.0L)1.0L；葡萄糖20.0g；琼脂15.0g；氯霉素0.1g，121℃，灭菌20min。[0036](2)麦芽汁培养基为：12Brix.麦芽汁1.0L，121℃，灭菌20min。[0037](3)酸性麦芽汁培养基：12Brix.麦芽汁1.0L，121℃，灭菌20min，在无菌条件下，用

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乳酸调节培养基酸度，形成酸度分别为：pH 2.0～4.0的酸性梯度麦芽汁液体培养基。[0038]实施例2耐酸酵母菌的鉴定

[0039]取1.0ml过夜培养的酵母菌液，加入1.5ml离心管中，室温10,000rpm离心1分钟，收集菌体。再用Ezup柱式酵母基因组提取试剂盒提取酵母菌基因组DNA，在OD 600nm处测其吸光值。然后，进行PCR扩增，26S rDNA D1/D2区序列的引物NL1和NL4，PCR反应为:预变性94℃4min；(94℃45sec，55℃45sec，72℃1min)30个循环；延伸72℃10min；4℃终止反应。扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，结果在NCBI的基因库中比对，用DNAman软件分析，将菌株的26S rDNA D1/D2区序列(约592bp)，如序列表中SEQ ID No.3所示，与标准菌进行相似度分析，该耐酸酿酒酵母菌与酿酒酵母菌相似度为100％，应为同一种菌。[0040]本发明酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)YR201705，已于2018年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC No.15315。[0041]实施例3添加到TMR饲料中的效果

[0042]以TMR为材料进行了TMR发酵添加试验。按TMR重量5％的添加量在TMR饲料中添加耐酸酿酒酵母菌悬液，按TMR重量5％的添加量，加入糖蜜，使TMR水分含量在45％～55％。经有氧发酵18h后，每千克的上述发酵料中加入植物乳酸菌1.0×108个以上。添加菌种后的TMR进行真空密封打包，每个处理装2袋，每袋约500g，置于室温下贮藏60d。[0043]营养成分及发酵指标测定方法如下：[0044](1)微生物检测：样品开封后，首先测定微生物指标。在超净工作台中，准确称取25g样品加入225ml无菌生理盐水，按GB 47.15-2016食品安全卫生标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数法进行检测。[0045](2)营养成分测定：将样品在65℃烘干后，检测其水分、粗灰分、粗蛋白、淀粉含量。实验应用凯氏定氮法测定样品中CP的含量；样品在550℃马福炉灼烧4h以上测定Ash；淀粉采用Megazyme试剂盒测定。[0046](3)发酵指标测定：取10g新鲜样品，加90ml蒸馏水，用榨汁机均质1min，4层粗纱布过滤，取35ml滤液，用pH计测定pH值。取上述滤液经3500r/min离心15min后，取上清液采用苯酚-次氯酸钠法测定氨态氮含量；取上清液经0.45μm滤膜过滤，用安捷伦(型号：1260)高效液相色谱仪测定：色谱条件：色谱柱(KC-811)流动相：0.02mol/L的KH2PO4，用H3PO4调pH至2.80；流速：0.7ml/min，柱温35℃；检测波长：210nm，进样量10μL。[0047]表1室温下，添加耐酸酿酒酵母对发酵TMR的化学及微生物成分的影响

[0048]

检测指标水分(％)粗蛋白(％DM)粗灰分(％DM)钙(％DM)总磷(％DM)淀粉(％DM)乳酸菌CFU/g添加普通市售酿酒酵母菌57.0618.136.700.750.4623.201.5×108

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添加耐酸酿酒酵母菌58.0717.246.100.620.4224.101.1×109

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酵母菌CFU/g02.1×106[0049]表2室温条件下添加耐酸酿酒酵母对TMR发酵品质的影响

[0050]

[0051]

在室温条件下，同添加普通市售酿酒酵母菌剂相比，本发明的耐酸酿酒酵母菌发

酵后的TMR，其乳酸含量略高于对照组，乙酸、丙酸、丁酸及氨态氮含量显著低于对照组，明显改善了TMR的发酵品质。在发酵第60天，对照组未检出酿酒酵母菌，而实验组仍有酿酒酵母菌生长，在气味方面显著优于对照组。[0053]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

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序　列　表

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序列表<110> 内蒙古优然牧业有限责任公司<120> 一株耐酸酿酒酵母菌及其应用<130> JLC19I0561E<160> 3<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1gcatatacaa taagcggagg aaaag 25<210> 2<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2ggtccgtgtt tcaagacgg 19<210> 3<211> 592<212> DNA<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400> 3agcggaggaa aagaaaccaa ccgggattgc cttagtaacg gcgagtgaag cggcaaaagc 60tcaaatttga aatctggtac cttcggtgcc cgagttgtaa tttggagagg gcaactttgg 120ggccgttcct tgtctatgtt ccttggaaca ggacgtcata gagggtgaga atcccgtgtg 180gcgaggagtg cggttctttg taaagtgcct tcgaagagtc gagttgtttg ggaatgcagc 240tctaagtggg tggtaaattc catctaaagc taaatattgg cgagagaccg atagcgaaca 300agtacagtga tggaaagatg aaaagaactt tgaaaagaga gtgaaaaagt acgtgaaatt 360gttgaaaggg aagggcattt gatcagacat ggtgttttgt gccctctgct ccttgtgggt 420aggggaatct cgcatttcac tgggccagca tcagttttgg tggcaggata aatccatagg 480aatgtagctt gcctcggtaa gtattatagc ctgtgggaat actgccagct gggactgagg 0actgcgacgt aagtcaagga tgctggcata atggttatat gccgcccgtc tt 592

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图2

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