药学实践杂志２０１ ３年１月２５日第３１卷第１期 ３５ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ ２５，２０１３ 白芨多糖提取方法的优选及其理化性质研究 韩 丹’，王艳萍。，毕亚静 ，刘福强 （１．延边大学药学院，吉林延吉１ ３３０００；２．解放军２０８医院，吉林长春１３００６２） ［摘要］ 目的 从白芨中等粉中用不同方法提取白芨多糖，优选最佳的提取工艺，对其理化性质进行研究。方法 采 用水提法、碱水提法、纤维素酶解法、超声波法进行提取；采用分光光度法测定多糖含量。得出多糖得率最高的一种方法为基 础，以多糖含量为指标进行工艺优化；按照《中国药典）２０１０年版一部规定的方法研究其理化性质。结果 超声提取法最好， 最佳提取工艺为：料液比１：２０，温度８０℃，时间１０ ｎｌｉｎ，提取率为４９．９０％；求出５个理化性质数据。结论 超声波提取法提 取白芨多糖的得率高于其他方法，适宜大规模生产；为白芨多糖现代化应用提供了依据。 ［关键词］ 白芨多糖；提取；苯酚一硫酸法；工艺优化；理化性质 ［中图分类号］ Ｒ２８４ ［文献标志码］ Ａ ［文章编号］ １００６—０１ １ １（２Ｏｌ３）【）ｌ一００３５—０３ ［ＤＯＩ］ １０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６—０１ｌ１．２Ｏ１３．０１．０ｌ０ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃ－ ｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ ＢｌｅｔｉＺｌａ ｓｔｒｉａｔａ ＨＡＮ Ｄａｎ ，ＷＡＮＧ Ｙａｎｇ．ｐｉｎｇ ，ＢＩ Ｙａ—ｊｉｎｇ‘，ＬＩＵ Ｆｕ ｑｉａｎｇ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｙａｎ Ｂｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｊｉ １３３０００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｈｅ ２０８ｔｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＰＬＡ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １ ３００６２，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ ０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｉｔｓ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｕｃｋ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｅ— ｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｃｔｒ。ｐｈｏｔｏｍｅｔ ｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ｔｈｅ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ ａｓ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｔｏ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｈ．Ｐ（２０１０）．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｕｈｒａｓｏｎｉｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｔｈａｔ：ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ ｗａｓ １：２０．ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ８０℃．ｉｎ １ ０ ｍｉｎ．Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｅ— ｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ４９．９０％．Ｆｉｖｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ ｗａｓ ｈｉｇｈ ｔｈａｎ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｍａｓｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｍｏｄｅｒｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｐｈｅｎｏｌ—ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ；ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ 白芨Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ是兰科白芨属，多年生草本 植物，有收敛止血、清热利湿、消肿生肌之功效 。 其块茎提取物主要成分为白芨多糖，化学组成为葡 甘聚糖 。本研究用５种不同方法进行提取，最终 选择一种提取多糖含量最高的方法，通过正交设计 进行工艺优化，确定最佳提取工艺，测定其理化性 质，为白芨多糖的应用奠定基础。 １仪器、材料与试剂 禾创超声仪器有限公司）；ｕｖ一３系列紫外可见分 光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；ＰＨＳ．３Ｃ精 密酸度计（上海虹美仪器仪表有限公司）；ＷＺＺ一２Ａ 数显自动旋光仪（上海索光光电技术有限公司）； ＮＤＪ一１旋转式粘度计（上海精密科学仪器有限公 司）。 １．２材料 白芨购于吉林省北药药材加工有限公 司，经嘉兴医学院王峻副教授鉴定为兰科植物白芨 Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ的干燥块茎，符合《中国药典》２０１０年 版（一部）该药材项下的有关规定。 １．３ 试剂 重蒸水，实验室自制；葡萄糖、甘露糖对 照品，均购于中国药品生物制品检定所（批号分别 为：１１０８３３—２００５０３；１４０６５１—２００３０１）；纤维素酶；三 氯甲烷、正丁醇、乙醇、硫酸、苯酚、氢氧化钠、碳酸 １．１ 仪器 ＺＫ一８２Ｂ型真空干燥箱（上海市实验 仪器总厂）；ＲＥ一５２０５旋转蒸发器（上海亚荣生化 仪器厂）；ＫＨ５２００ＤＥ型数控超声波清洗器（昆山 ［基金项目］ 国家自然科学基金（８ｌ１７３５５９）． ［作者简介］ 韩丹（１９８５．），女，硕士研究生．Ｔｅｌ：（０４３１）８６９８８１８７ Ｅ—ｍａｉｌ：ｍ ｈａｎｄａｎ＠１６３．ｅｏｍ． 钡、羧甲基纤维素钠、乙酸乙酯、乙酸、甲醇、苯胺、二 药学实践杂志２０１３年１月２５日第３１卷第１期 苯胺，均为ＡＲ级。 ２ 方法 ２．１ 提取方法 斑点。 ２．３含量测定 （苯酚一硫酸法） ２．３．１ 对照品溶液的制备 精密称取经真空干 燥１２ ｈ的葡萄糖对照品１．５ ｍｇ，加水定容至２５ ｍｌ 容量瓶中，摇匀，即得每１ ｍｌ含６０ ｇ的对照品溶 液。 ２．１．１ 回流法 称取白芨中等粉２０ ｇ，加２０倍量 体积水，用沸水浴回流提取４ ｈ，重复提取３次，合并 提取液，滤过，滤液于旋转蒸发仪中减压浓缩至稠膏 状，加３倍量体积９５％乙醇沉淀，抽滤，５５℃真空干 ２．３．２供试品溶液的制备 精密称取５种提取方 法下的多糖粗品０．６ ｍｇ，加水定容至１０ ｍｌ容量瓶 燥，即得多糖粗品。 ２．１．２ 浸提法 称取白芨中等粉２０ ｇ，加２０倍 量体积水，在８０℃下浸提４ ｈ，重复提取３次，以下 步骤同２．１．１项（自合并提取液）。 ２．１．３ 超声波法 称取白芨中等粉２０ ｇ，加２０ 倍量体积水，在８０℃下超声提取３０ ｍｉｎ，重复提取 ３次，以下步骤同２．１．１项（自合并提取液）。 ２．１．４ 碱水提法 用氢氧化钠试液将水调至 ｐｉｌｌ０，称取白芨中等粉２０ ｇ，加２０倍量体积碱水， 在８０℃下浸提４ ｈ，重复提取３次，以下步骤同 ２．１．１项（自合并提取液）。 ２．１．５纤维素酶解法 精密称取纤维素酶３００ ｍｇ，溶于少量水中，４０。（＝活化４０ ｍｉｎ，取白芨粉末 ２０ ｇ，加１倍水浸泡３０ ｍｉｎ，将浸泡好的白芨及活 化好的酶同时倒入１５０ ｒｎｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ５） 中，５０℃酶解１．５ ｈ。加２０倍量体积水，在８０℃ 下浸提４ ｈ，重复提取３次，以下步骤同２．１．１项 （自合并提取液）。 ２．２ 多糖的鉴别 ２．２．１显色反应 精密称取５种提取方法下的 提取物１０ ｍｇ加水定容至１０ ｍｌ容量瓶中，摇匀。 分别取４ ｍｌ，加稀盐酸０．５ ｍｌ，水浴加热３０ ｒａｉｎ，取 出，放冷，加氢氧化钠适量调至中性，再加斐林试剂 ３ ｍｌ，水浴加热，结果斐林反应呈阳性。 ２．２．２单糖的鉴别 精密称取多糖样品１０ ｍｇ， 加２ ｍｏｌ／Ｌ硫酸ｌ０ ｍｌ，１００ ｃＣｊ水解８ ｈ，加适量碳酸 钡中和，抽滤，滤液蒸干，残渣加乙醇１ ｍｌ使溶解， 作为供试品溶液。另分别取葡萄糖、甘露糖，加乙醇 制成每１ ｍｌ含１ ｍｇ的溶液，作为对照品溶液。照 《中国药典｝２０１０年版一部附录ⅥＢ试验，吸取对照 品溶液各２ ｔｘｌ、供试品溶液２～４ ｌ，分别点于同一 以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶Ｈ薄层板上，以 正丁醇一乙酸乙酯一乙酸一甲醇一水（２：１２：４：４：１） 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以苯胺一二苯胺溶液， 在１０５℃加热至斑点显色清晰。日光下检视，供试 品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜 色的斑点。置紫外光灯（３６５ ｎｍ）下检视，供试品色 谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的 中，摇匀，即得。 ２．３．３测定波长的选择 精密量取供试品溶液和 葡萄糖对照品溶液各１．０ ｍｌ置试管中，分别加入水 １．０ ｍｌ，６％苯酚溶液１．０ ｍｌ，硫酸５．０ ｍｌ，混匀，室 温下放置１０ ｍｉｎ，摇匀，静止２０ ｍｉｎ。以水为空白， 在４００～８００ ｎｍ波长范围内扫描。结果对照品和供 试品在４９０ ｎｍ波长处均有最大吸收，确定４９０ ｎｍ 作为测定波长。 ２．３．４ 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液 ０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０ ｍｌ，分 别加水至２．０ ｍｌ，再加入６％苯酚１．０ ｍｌ及硫酸 ５．０ ｍｌ，静置１０ ｒａｉｎ，摇匀，室温放置２０ ｍｉｎ，以水 为空白，于４９０ ｌ｜ｍ波长处测定吸光度（Ａ）。以葡 萄糖质量浓度为横坐标（ ），吸光度为纵坐标（ｙ）， 绘制标准曲线，得回归方程Ｙ＝０．０５２ ２Ｘ一０．００６ ２ （ｒ＝０．９９９ ９），葡萄糖在２４～１２０ ｔｘｇ呈良好的线性 关系。 ２．３．５样品的测定 精密吸取上述样品溶液１．０ ｍｌ，按２．３．４项下步骤操作，测定吸光度，代人标准 曲线计算含量，结果见表１。结果表明超声提取法 提取率最好。 表１ 白芨多糖不同提取方法的提取效果比较 ３最佳提取方法的工艺优选 ３．１ 正交试验优选 在预试验的基础上，认为超 声波提取法最好，拟定影响多糖得率的３个因素 即料液比（药材质量ｇ／所用溶剂的体积ｍ１）、提取 时间（ｍｉｎ）和温度（０Ｃ）为优选因素，每个因素设定 ３个水平进行正交试验。选Ｌ。（３ ）正交表进行设 计，并以多糖含量作为考察指标，确定最佳提取工 药学实践杂志２０１３年１月２５日第３１卷第１期 ３７ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ ２５，２０１３ 艺，结果见表２、表３。 表２影响白芨多糖提取的因素水平表 同时对其溶解性进行考察，结果显示白芨多糖 易溶于热水，微溶于冷水，不溶于乙醇。 ５讨论 白芨多糖在医学研究和临床等诸多方面的广泛 应用，显示出良好的发展前景。但在大多数基础和 临床研究中，所用的白芨仅是经过粗略水提或直接 表３正交试验安排及结果 采用白芨药材原粉，制备工艺简单，质量差异较大， 对各项研究结果的重现性有较大影响。本实验以多 糖含量为指标，采用回流法、水提法、碱水提法、纤维 素酶解法、超声波５种方法进行提取，选择一种获得 多糖含量最高的方法，并通过正交设计对该种方法 进行工艺优选，结果最佳工艺条件为Ａ：Ｂ Ｃ。，即料 液比为１：２０，提取温度８０ ｃＣ，提取时间１０ ｍｉｎ。 通过验证试验表明，正交实验优选确定的最佳工艺 水平是可行的，有利于实际生产，节约时间，具有良 好的应用前景。 【参考文献】 孙达锋，史劲松，张卫明，等．白芨多糖胶研究进展［Ｊ］．食品 科学，２００９，３０（３）：２９６． 直观分析表明，在所选因素水平范围内，影响因 素Ｂ＞Ｃ＞Ａ，即温度＞时间＞料液比，最佳的提取 条件为Ａ Ｂ Ｃ ，即料液比为１：２０，温度为８０℃，时 间为１０ ｍｉｎ。 ［２］ 刘光斌，黄忠，黄长干，等．白芨多糖提取工艺的研究［Ｊ］． 中国现代应用化学杂志，２００７，２４（４）：２８９． ［３］ 舒任庚，蒋跃平，蔡永恒．植物多糖的提取分离方法探讨［Ｊ］． 中国药房，２０１１，２２（１１）：１０５２． ［４］ 张楷正，杨跃寰，李光辉，等．香菇多糖提取方法研究进展 ３．２ 最佳提取条件的验证试验 按照上述优选工艺 Ａ Ｂ ｃ，进行３次重复试验，白芨多糖的含量分别为 ６１．１８％，６１．８８％，６２．３５％，说明该工艺稳定可行。 ４理化性质测定… 按照药典规定的方法，对白芨多糖的特性黏度、 ［Ｊ］．四川理工学院学报，２００９，２２（６）：６３． ［５］ 闫巧娟，韩鲁佳，江正强．纤维素酶解法提取黄芪多糖［Ｊ］．中 草药，２００５，３６（１２）：１８０４． ［６］ 田河林，韦立顺，悦随士．白芨胶的提取及理化特性测定［Ｊ］． 中国临床医药研究杂志，２００４，（１１５）：１２９０３． ［７］ 朱小平，吴东儒．白芨多糖分离、纯化、组成及其性质［Ｊ］．安 徽大学学报，１９９１，（４）：８６． 比旋度、ｐＨ值、熔点进行了测定，结果见表４。 表４ 白芨多糖理化参数测定结果 ［８］ 魏绍云，齐慧玲，王继伦，等．苯酚一硫酸法测定白芨多糖［Ｊ］． 天津化工，２０００，（３）：３５． ［９］ 陈景耀，吴国荣，王建安，等．正交试验优选白芨多糖硫酸酯 化工艺的研究［Ｊ］．中草药，２００５，３６（１）：４３． ［１０］ 中国药典一部［Ｓ］．２Ｏｌ０年版． ［收稿日期］２０１２－０９－０４ ［修回日期］２０１２－１１－１２ 欢迎订阅２ ０ １ ３年《药学实践 杂志》 ｅｄｕ．ｃａ 本刊网址：ＷＷＷ．ｉＸＳｉＺＺ．ｃａ：，／ｘｓｉ．ｓｍｍｕ．
