胰腺癌胰液蛋白质组学分析

田美,等 胰腺癌胰液蛋白质组学分析

×实验研究Ø

胰腺癌胰液蛋白质组学分析

田美, 崔亚洲, 宗美娟, 陈彧, 韩金祥

山东省医学科学院山东省医药生物技术研究中心国家卫生部生物技术药物重点实验室山东省

医学分子生物学重点实验室,山东济南250062

Comparativeproteomicsanalysisonpancreaticcancerjuice

TIANMei,CUIYa2zhou,ZONGMei2juan,CHENYu,HANJin2xiang

ShandongMedicalBiotechnologicalCenter,ShandongAcademyofMedicalSciences,KeyLaboratoryforBiotech2DrugsofHealthMinistry,KeyLaboratoryforMedicalMolecularBiologyofShandongProvince,Jinan250062,P.R.China=摘要> 目的:利用比较蛋白质组学方法鉴定胰腺癌早期诊断的蛋白标志。方法:采用双向电泳(22DE)分离比较9个胰腺导管腺癌患者和9个非胰腺癌患者的胰液蛋白质表达谱,用肽质量指纹图谱(PMF)为基础的基质辅助激光解析离子化飞行时间串联质谱(MALDF2TO2F2MS/MS)对差异蛋白进行鉴定。采用蛋白质印迹方法进一步验证蛋白质MMP29和DJ21在胰液中的表达。结果:22DE显示共24个蛋白质点出现>210倍的表达差异,上调14个,下调10个。蛋白质印迹检测显示在胰腺癌胰液中高表达MMP29和DJ21蛋白。结论:MMP29和DJ21可能成为通过内镜下逆行胰胆管造影术(ERCP)筛查胰腺癌高危患者及早期诊断胰腺癌的潜在的胰液肿瘤标志。

中华肿瘤防治杂志,2008,15(15):1140-1143

[ABSTRACT] OBJECTIVE:Toidentifyproteinmarkersfortheear2lydiagnosisofpancreaticcancerbyacomparativeproteomicmethod.METHODS:Acomparativeanalysisonthepancreaticjuiceproteinprofilingfrom9pancreaticcancerpatientsand9cancer2freecontrolswascarriedoutbytwo2dimensionalgelelectrophoresis(22DE),anddifferentiallyexpressedproteinswereidentifiedbypeptidemassfinger2print(PMF)basedonmatrix2assistedlaserdesorption/ionization2timeofflighttandemmassspectrometry(MALDI2TOFMS/MS).Matrixmetalloproteinase29(MMP29)andOncogeneDJ1(DJ21)inpancreaticjuicewerefurtherconfirmedusingwesternblotting.RESULTS:22DEdisplayedatotal24proteinspotswithatleast2102foldofdifferentialexpression,ofwhich14proteinspotswereup2expressedand10weredown2expressedinpancreaticcancerjuices.WesternblottingdetectiondemonstratedMMP29andDJ21highlyexpressedinpancreaticjuicefrompancreaticcancercomparedwithcancer2freecontrols.CONCLU2SION:MMP29andDJ21proteinsmightbepromisingbiomarkercandi2datesforscreeningofhigh2riskpatientsundergoingERCPandtheear2lydiagnosisofpancreaticcancer.

ChinJCancerPrevTreat,2008,15(15):1140-1143

=关键词> 胰腺肿瘤;胰液;蛋白质组学;肿瘤标志,生物学

[KEYWORDS] pancreaticneoplasms;pancreaticjuice;proteomics;tumormarkers,biological

=中图分类号> R735.9 =文献标识码> A =文章编号> 1673-5269(2008)15-1140-04

胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤,恶性程度高,治疗困难,预后差。有研究显示,筛查为胰腺癌的早期诊断提供基础,可降低筛查人群的死亡率,改善预后。当前常用的筛查方法主要包括CT、超声内镜及利用

=基金项目> 山东省科技厅重点攻关资助项目(2005GG1102003)=第一作者简介> 田美,女,山东成武人,硕士,主要从事蛋白质组学的研究工作。

Tel:86-531-82919608 E2mail:genomeresearch@163.com=通讯作者简介> 韩金祥,男,山东夏津人,博士,研究员,博士生导师,主要从事医学分子生物学的研究工作。

Tel:86-531-82919611 E2mail:Jxhan9888@yahoo.com.cn

内镜下逆行胰胆管造影术(ERCP)检测胰液中的癌基因肿瘤标志[1]。然而,通过ERCP获取的胰液标本也富集由胰腺导管细胞所释放的癌特异性蛋白[2]。本研究应用蛋白质组学的方法,鉴定胰腺癌早期诊断的蛋白标志,以期寻找胰液中较理想的蛋白标志。

1 材料与方法

1.1 标本

2005202~2007212山东大学齐鲁医院确诊为胰腺导管腺癌的5例患者和9例上消化道功能性不良患者,9例患者均行内窥镜逆行性胆胰管造影术(ERCP)

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检查,排除了肿瘤和慢性胰腺炎等器质性疾病。另外选取山东省千佛山医院同期住院的4例胰腺导管腺癌患者。所有患者均取1mL胰液标本。

1.2 试剂

尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris2base、32[(2cholamidopropy1)dimethyl2amm2onio212propanesulfonate(CHAPS)]、二硫苏糖醇(DTT)、苯甲基磺酰氟化物(PMSF)、碘乙酰胺(IAA)、蛋白质定量试剂盒(2DQuantKit)和固相pH梯度干胶条(IPGstrippH3~10NL,24cm)均购自AmershamBiosciences公司。丙酮和三氟乙酸液(115mol/LTris2HClpH818,6mol/LUrea,87%甘

油,2%SDS,215%IAA,0.2%溴酚蓝)中各平衡15min。垂直SDS2PAGE电泳:将平衡后的IPG胶条转移至1215%的凝胶上端,使IPG胶条与凝胶上端紧密贴合,排尽气泡后,用含012%溴酚蓝的015%琼脂糖封顶。电泳参数设置:第1步012W/胶,1h;第2步014W/胶,1h;第3步17W/胶,12h,直至溴酚蓝指示线跑至胶底缘时电泳结束。所有的凝胶采用考马斯亮蓝R350染色。1.6 图像分析

通过PowerLook2100XL扫描仪扫描考染后的(TFA)购自FlucaBiochemika公司。A2氰基242羟基肉桂酸(CHCA)购自Sigma公司。胰酶购自Promega公司。抗MMP29抗体和抗DJ21抗体及辣根酶标记的羊抗鼠和羊抗兔IgG均购自Sigma公司。ECLPluskit购自AmershamBiosciences公司。1.3 仪器

EttanIPGphorÒ等电聚焦仪(GEHealthcare),EttanDALTtwelve垂直电泳仪(AmershamBiosci2ences),PowerLook2100XL扫描仪(Umax公司),4700型基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI2TOF2MS)为美国ABI公司产品。1.4 样品处理

收集的胰液标本经4e、10000r/min(R=9cm)离心20min后,去除沉淀,将上清分装,-80e保存备用。取上述分装的胰液标本300LL,加入预冷的丙酮(1200LL),置于-20e,2h。然后4e、13000r/min(R=9cm)离心10min,去上清;剩余的沉淀用1mL丙酮漂洗,混匀后,4e、13000r/min(R=9cm)离心10min,去上清,室温干燥5~10min,再用500LL裂解液(8mol/LUrea,2mol/LThiourea,2%CHAPS,10LL/mLPMSF,18mmol/LDTT,015%IPG缓冲液,pH3~10NL)裂解沉淀1h。之后将裂解完后的混合物4e、12000r/min(R=9cm)离心10min去除沉淀,吸取的上清液即为提取的胰液总蛋白。用蛋白质定量试剂盒(2DQuantKit)测定蛋白质的浓度。1.5 双向电泳

等电聚焦(IEF):参照IPGphor等电聚焦系统使用指南进行。胰液总蛋白质提取物(400Lg)与水化液(8mol/LUrea,2%CHAPS,18mmol/LDTT,015%IPG缓冲液pH3~10NL,01002%溴酚蓝)充分混合,上样总体积为450LL。30V水化12h后,500V1h、1000V1h和8000V815h进行等电聚焦,水化和聚焦均在20e进行,总电压时间积为65000Vhr。平衡:等电聚焦后迅速取出IPG胶条分别置于12mL平衡A液(115mol/LTris2HClpH818,6mol/LUrea,87%甘油,2%SDS,1%DTT,0.2%溴酚蓝)和12mL平衡B

凝胶而获得图像,使用ImageMaster2DPlatinum510凝胶图像分析软件(GEHealthcare)对图像进行点检测、背景消减、匹配和比较差异等分析,从而获取斑点的相关信息。

1.7 胶内酶解和MALDI2TOF2MS/MS鉴定

将43个差异蛋白质点从凝胶上切割下来后置115mLEppendorf管中,用脱色工作液(50mmol/LNH4HCO3和ACN1B1用前混合)放置在37e水浴脱色,直至蓝色消失,乙腈脱水直至胶块变为白色。再用10Lg/LL胰酶(Trypsin)吸胀胶块置于4e,30min。然后吸出多余的胰酶,在胶块内加入25mmol/LNH4HCO3置于37e水浴酶解过夜。再用萃取液(50%ACN+5%三氟乙酸)萃取置于37e,1h;合并上清及萃取液,在Eppendorfconcentrator5301离心机中4e、10000r/min(R=9cm)离心浓缩抽干样品。然后再用溶解液(30%ACN+1%三氟乙酸)溶解样品,取015LL样品与等体积饱和的CHCA基质液混合,点样于不锈钢点样板上,空气中干燥,然后在MAL2DI2TOF2MS/MS质谱仪上分析。当质荷比达到800~3500D时,获得肽质量指纹图谱(PMF)。选取最强的5个峰值来获得MS/MS数值。最后通过Mascot软件检索SwissProt数据库鉴定蛋白质。

1.8 蛋白质印迹检测MMP29和DJ21蛋白的表达

胰液标本取自在双向电泳分析中所使用的任意6例胰腺癌患者和6例非胰腺癌患者。样品经丙酮处理和蛋白定量后,在具有10道双垂直电泳槽内每孔内加入30g蛋白质,进行SDS2PAGE电泳,结束后半干转至NC膜。在摇床上用5%脱脂牛奶封闭1h,杂交一抗(抗DJ21抗体和抗MMP29抗体),4e过夜。TBST洗膜3次,每次10min。杂交二抗,室温摇床上1h,TBST洗膜3次,每次10min,ECLPlus试剂盒显色。1.9 数据分析

用ImageMaster2DPlatinum510图像分析软件(GEHealthcare)对差异蛋白点进行比较分析,得到蛋白点的强度值,若强度比值>210说明蛋白点具有表达差异。

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田美,等 胰腺癌胰液蛋白质组学分析

2 结果

2.1 差异蛋白点的鉴定和分析

把所有的差异蛋白点进行胶内酶解和质谱分析,经SwissProt数据库检索,共成功的鉴定出24个相应

的蛋白质,在胰腺癌胰液中上调14个,下调10个(表1)。经比较分析发现24个差异蛋白质点均出现>210倍的表达差异(图1)。这些上调的蛋白点可能成为胰腺癌标志研究中的新的候选蛋白。

表1 胰腺癌胰液与非胰腺癌胰液比较的差异表达蛋白质

位点上调蛋白点

14061394210616521312147121932196154319711253131821551739

下调蛋白点2048180720072114205220301967185720642129

x

蛋白名称

Alpha212antitrypsinprecursorSerumalbuminprecursorApolipoproteinA2IprecursorGlutathioneS2transferasePAlpha21B2glycoproteinprecursorVitaminD2bindingproteinprecursorCationicantimicrobialprotein

Superoxidedismutase[Mn],mitochondrialprecursorSerotransferrinprecursorIglambdachainV2IVregionHilmatrixmetalloproteinase29HemopexinprecursorOncogeneDJ1

FibrinogenbetachainprecursorTrypsin21precursor

CarboxypeptidaseA2precursorComplementC42BprecursorChymotrypsinogenBprecursorElastase23AprecursorElastase23BprecursorFibrinogen2likeprotein1precursorHaptoglobinprecursorTrypsin23precursor

ComplementC3precursor

相对分子质量(D)等电点

46737693673077832311542735296426886247227705011517784275167619891559282655846828192793278702947529293363924520532499187148

5.375.925.565.435.585.409.758.356.816.045.696.556.338.546.085.686.736.796.435.655.586.137.466.02

蛋白分值蛋白可信区间比值倍数x覆盖率(%)29849128990124300127109519102214213114247121208123146143157196163120248

xx

xx

100100100

99.998100100

99.997100100100100100100100100100100100100100100100100100

3.432.674.833.842.395.602.732.545.092.663.673.232.594.15-2.64-13.00-2.10-2.43-5.71-23.00-2.71-2.00-2.82-3.78

39.78873.49356.05468.24933.86360.62238.51236.52476.67449.05632.45842.28915.87853.06735.17652.44931.48836.05135.15642.94557.34745.01327.11854.849

在胰腺癌胰液中的24个差异蛋白质出现>210倍的表达差异,负号是指下调的蛋白点;根据Mascot搜索引擎获知蛋白点的序列覆盖率

2.2 蛋白质印迹分析

通过蛋白印迹分析得知差异蛋白质MMP29和DJ21在胰液中的表达水平。结果显示在所有的6例胰腺癌胰液标本中MMP29和DJ21都高表达,且获得的蛋白条带与MMP29的相对分子质量92@103和82@10相符合,分别为MMP29的活化前体和激活形式。DJ21的蛋白条带也与它的相对分子质量28@103相符合(图2)。但是,MMP29和DJ21在所有的非胰腺癌患者胰液标本中均不表达。

3

Serumalbuminprecursor、Fibrinogenbetachainpre2cursor、GlutathioneS2transferaseP、matrixmetallo2proteinase29和OncogeneDJ21在以前胰腺癌组织研究中也发现是差异表达的[3-6]

。7个上调的matrix

metalloproteinase29、OncogeneDJ21、ApolipoproteinA2Iprecursor、Alpha21B2glycoproteinprecursor、Su2peroxidedismutase[Mn]、Serotransferrinprecursor和IglambdachainV2IVregionHil,在本研究中多次被检测到。因此,这些蛋白可能成为筛查高危患者和早期诊断胰腺癌的重要的候选标志。

通过免疫印迹分析,本研究进一步验证了MMP29和DJ21在胰液中的表达水平。MMP29,是基质金属蛋白酶的4个主要亚群之一,属于含锌的蛋白水解酶家族,在胰腺癌变过程中它可破坏细胞外基质导致基底膜降解[7,8]。在胰腺癌中过量表达的MMP29与胰腺癌的局部浸润或远距离转移及较差的预后有关

[5,9]

3 讨论

蛋白质组学其高通量的特点为检测胰腺癌的早期诊断标志提供了强有力的工具。本研究在胰液水平上进行差异蛋白质组学研究,获得了胰腺癌和非胰腺癌胰液的蛋白表达谱,且每组中选取不同的个体样品重复3次,从每组胶中筛选出分辨率高和重现性好的胰液22DE图谱,通过差异比较分析和质谱鉴定,在43个差异表达蛋白质点中共检测到24个蛋白质,14个蛋白质是在胰腺癌胰液中上调的,其中5个上调的

。

本研究通过22DE和质谱技术在胰腺癌胰液中分离和鉴定了MMP29蛋白;且在免疫印迹分析中显示MMP29在6个胰腺癌胰液标本中均高表达,并检测到

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它的两种异构体形式。有文献报道DJ21与多种癌症有关[10,11]。Tillman等[12]发现DJ21可能是促使前列腺癌进展的间接雄性受体。Melle等[9]使用22DE和蛋白芯片技术检测到DJ21在胰腺癌组织中高表达。本研究在胰腺癌胰液中分离和鉴定了DJ21,并通过免疫印迹方法进一步验证了其在胰液中的表达情况,发现DJ21在6个胰腺癌胰液标本中是高表达的,在6个非胰腺癌胰液中均不表达。

总之,这些与胰液有关的蛋白标志可通过ERCP进行筛查高危患者,或者与其他标志联合检测来改善胰腺癌的早期诊断。关于这些蛋白质的进一步验证、临床应用及功能学意义,正在进行深一步研究。

=参考文献>

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收稿日期:2008-02-16 修回日期:2008-03-20

(编辑:王秀华)