UPLCMSMS质谱检测法：快速分析婴幼儿配方奶粉中的水溶性维生素

UPLC/MS/MS质谱检测法：

快速分析婴幼儿配方奶粉中的

水溶性维生素

□沃特世科技（上海）有限公司 供稿

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维生素是一种微量营养元素，人体自身无法合成，只能通过食物摄取。因维生素对婴儿健康成长起着至关重要的作用，所以常被添加于婴幼儿营养配方奶粉中。然而，由于维生素结构多样、化学成分复杂，在奶粉中含量低、浓度范围广，并且在光和热作用下不稳定，因此使用一种检测方法对婴幼儿配方奶粉中的维生素进行分析是件非常困难的事情。官方采用的水溶性维生素检测方法是以程序化为基础的微生物鉴定法。此方法中，为达到提取目的，需对每种维生素都进行单独分析，并测定其在食物里的总含量，程序繁琐且耗时。本文中沃特世向读者介绍了一种只需5分钟就可获得检测结果的快速检测方法－UPLC®/MS/MS质谱检测法，该法利用ESI正模式可同时检测婴幼儿配方奶粉中的12种水溶性维生素，可实现在复杂基质（如婴幼儿配方奶粉）中检测低浓度目标物(尤其是维生素B12)，并通过一次分析即可同时获得多反应监测(MRM)和全扫描数据。剂均储存在低于5℃的避光处。维生素标准溶液每日制备。液相条件

LC系统：ACQUITY UPLC®系统色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，2.1×50mm，1.8μm色谱柱温度：40℃样品温度：4℃流速：0.6mL/min流动相A：10mM甲酸铵+0.1%甲酸水溶液流动相B：10mM甲酸铵+0.1%甲酸甲醇溶液梯度：时间（分钟）0.02.03.03.14.05.0%A99994519999%B11559911脱溶剂气速：1200L/h采集：多反应监测(MRM)及RADAR全扫描碰撞气：氩气3.5×10-3mbar标准添加法

当无法获得空白试样时，婴幼儿配方奶粉中水溶性维生素的定量分析将通过标准添加法进行(烟酰胺除外)。在试样中添加已知浓度（标准溶液）的分析溶液，使任何基质效应都可在校准时消除；并且分析人员可对分析样品中加入的标准溶液含量以及加入标准溶液后仪器响应的变化进行追踪。因此，通过校准曲线外推法可测定试样中分析物的浓度。实践中，标准溶液的添加体积需保持在少量水平，以避免样品基质的稀释。试样基质使用现有稀释系数，无标准品添加，仪器对婴幼儿配方奶粉中烟酰胺（B3）的响应接近检测器饱和值。如果标准总运行时间：5.0min注入量：10μL，全充满定量环质谱条件

MS系统：Xevo® TQ MS离子化：ESI+毛细管电压：1.0kV添加法用于烟酰胺，将使检测器达到饱和。试样准备、萃取和标准添加

按婴幼儿配方奶粉包装说明上的3倍浓度进行制备。将10mL婴幼儿配方奶粉溶液放入用箔覆盖的聚丙烯（PP）管中，加入20mL100%浓度的乙醇，晃动2min，再以3500RPM的速率分析条件与步骤

在样品准备和分析阶段，所有溶源温度：150℃脱溶剂温度：600℃2010年11月刊34 食品安全导刊 Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.离心15min。上清液用0.45μmPVDF滤膜过滤.然后将20μL上清液转移至样品瓶，加入10μL含11种分析物的已知标准浓度溶液，样品瓶加水至1mL （将试样基体中的分析物稀释50倍，标准溶液中的分析物最终稀释100倍）。溶液中烟酰胺标准曲线单独制备，通过LC/MS/MS进行分析。采集和数据处理方法

通过MassLynxTM4.1版软件获取数据，使用TargetLynxTM应用管理软件进行数据处理、使用IntelliStartTM技术对12种目标维生素进行自动MRM采集方法优化。IntelliStartTM技术只需输入复合物的基本信息，即可自动找到母离子、优化锥孔电压、找到子离子并优化碰撞能量。每种维生素的2个MRM通道（第一个通道为定量离子通道，第二个通道为定性离子通道）均已得到优化。同时，通道的驻留时间也自动得到优化，每个色谱峰最少有12点以保证定量重现性。分析物的MRM通道、锥孔电压、碰撞能量、以及保留时间详见表1。RADARTM是一种可获丰富信息的采集方法，其在获取MRM数据的同时可实时获取试样基质的背景质谱信息，而且使用RADARTM不会影响MRM数据的质量。图1 RADAR技术可通过一次分析同时获取MRM和全扫描数据样品基

质中非目标物质谱图如嵌入的全扫描数据所示

结果与讨论

ACQUITY UPLC®系统结合Xevo® TQ MS的ESI正离子模式，成功分析了12种水溶性维生素。使用ACQUITY UPLC®可在5分钟内快速分离所有分析物，包括1分钟平衡时间，详见图1。在同一分析检测中，可使用Xevo®TQ MS的RADARTM模式监测婴幼儿配方奶粉基质中化合物的全扫描质谱信息。RADARTM利用Xevo® TQ MS的快速采集速率获取全扫描MS数据，且同时在MRM模式下得到足够的分析物峰点数，以准确定量和定性。 化合物含量和类别。这对LC-MS/MS方法开发过程中优化方法以降低基质影响带来帮助。例如，可通过调整分离方法使得目标峰与可能引起基质影响或离子抑制的区域分离。图1中插入部分为从婴幼儿配方奶粉试样基质全扫描数据中提取的质谱图。此方法检测了两种不同大众品牌的婴幼儿配方奶粉。图2显示的是从其中一种品牌里提取的水溶性维生素定量离子色谱图。回收率与重现性

通过对提取前后的加标样品进行比较，得到回收表1 检测水溶性维生素的LC/MS/MS参数

分析物抗坏血酸C硫胺素B1烟酸B3吡哆醛B6吡哆醇B6烟酰胺B3泛酸B5氰钴胺B12叶酸B9核黄素-5'-磷酸B2生物素B7核黄素B2170.0265.2124.0168.0170.0123.0220.1678.6442.2457.2245.1377.2141.0/95.0.122.0/144.080.2/53.0150.0/94.0152.0/134.080.0/106.0 90.0/202.1147.1/359.2295.1/176.0439.2/359.2227.0/97.0243.1/172.11618341420322030183020368/1216/1220/2214/24 12/2018/1214/1236/2416/3616/2014/3024/420.370.410.510.640.860.932.732.982.993.043.103.15实验分两天进母离子(m/z)子离子1/子离子2(m/z)锥孔电压(V) 碰撞能量1/碰撞能量2(eV)保留时间(分钟)率。行，实验内容为检测两种不同品牌的婴幼儿配方奶粉，每日重复进行6次。每种婴幼儿配方奶粉的大部分化合物都达到了≥90%的提取回收率，吡哆醛、叶酸和核黄素-5’-通过RADARTM可观察试样基质中的杂质，并了解可能造成基质效应的磷酸等物质，由于水溶性较差，导致回收率相对较低。尽管婴幼儿配方奶除MRM数据外，使用Xevo®TQ MS的RADARTM模式可获得全扫描数据。Nov 2010 CHINA FOOD SAFETY 35Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.低于5%，这充分显示了该方法的高重现率以及稳定性。表2显示两种婴幼儿配方奶粉产品提取前加标样本的回收率和水溶性维生素RSDs百分比。线性和定量

线性动态范图2 婴幼儿配方奶粉里提取的水溶性维生素定量离子色谱图

基质效应，消除离子抑制的影响，从而得到相关系数≥0.99的较好线性关系。如表3所示，所有进行分析的婴幼儿配方奶粉浓度范围不同：抗坏血酸（C）为10～10000ng/mL；氰钴胺（B12）为0.1～10.0ng/mL；其余分析物为1～100ng/mL。校正曲线为外推法，由于考虑到稀释因素(50x)，x轴截距绝对值显示婴幼儿配方奶粉中分析物的浓度。Xevo® TQ MS的灵敏度让我们可稀释样本以降低基质效应，同时仍可检测到目标化合物。围、灵敏度和适合粉是一种非常复杂的基质，但6个重复样的相对标准偏差（RSDs）仍然都性可通过标准添加法进行评测。标准添加法的一大优势是可避免测定表2 两种婴幼儿配方奶粉产品提取前加标样本的回收率和水溶性维生素RSDs百分比

配方奶粉A分析物抗坏血酸C硫胺素B1烟酸B3吡哆醛B6吡哆醇B6烟酰胺B3泛酸B5氰钴胺B12叶酸B9核黄素-5'-磷酸B2生物素B7核黄素B2101010101010101001001010100.498.790.383.598.9101.6104.2.486.677.695.4102.71.11.64.01.20.70.51.91.03.72.22.21.899.4118.696.496.4100.198.7112.6106.282.075.198.7103.3配方奶粉B1.12.24.21.10.70.60.80.92.42.82.42.2加标水平（ng/g）平均回收率（%）%RSD（n=6）平均回收率（%）%RSD（n=6）结论

使用ACQUITY UPLC®与Xevo® TQ MS ESI正模式5分钟快速测定法，可同时分析12种水溶性复合维生素。此法将不同维生素分析法融为一体，可提高实验室试样分析量、减少容积消耗、降低运作成本。 Xevo® TQ MS的高灵敏度可在非常复杂的基质中检测低浓度目标分析物 (尤其是氰钴胺)，如婴幼儿配方奶粉。Xevo® 表3 校正曲线相关系数(R2)，以定量为基础，

A配方奶粉中水溶性维生素的浓度计算。

分析物抗坏血酸C硫胺素B1烟酸B3吡哆醛B6吡哆醇B6烟酰胺B3泛酸B5氰钴胺B12叶酸B9生物素B7核黄素B2R20.9930.9900.9990.9960.9980.9920.9940.9940.9930.9970.992浓度计算(ng/g)1981301778-20523541420181138.3152-651143图3 使用标准添加法的A配方奶粉的抗坏血酸和维生素B12校正曲线

TQ MS可达到低定量限，稀释试样来降低基质效应。RADARTM技术可监测基质干扰，杂质和样品中的降解物，同时准确定量目标分析物。分析员在检测基质效应时便可做出准确决策，并可准确评价基质效应是否有存在。IntelliStartTM技术简化系统准备和MRM方法开发，确保所有层次的分析检测人员均可快速准确地操作仪器，从而生成最高质量的可重现的UPLC/MS/MS数据。核黄素-5'-磷酸B20.9972010年11月刊36 食品安全导刊 Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.