第３７卷第１期 南华大学学报・医学版 ２００９年１月 Ｖｏ１．３７ Ｎｏ．１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｊａｎ．２ｏｏ９ ・肿瘤学研究・ ＶＥＧＦ反义寡核苷酸与顺铂联合治疗抑制 裸鼠骨肉瘤的生长 方松清，曾谷清 （南华大学医学院外总手术学教研室，湖南衡阳４２１００１） 摘要： 目的探讨血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）反义寡核苷酸和顺铂单用或联用对裸鼠骨肉瘤生长的抑制 作用。 方法 制备ＢＡＬＣ／Ｃ裸鼠皮下骨肉瘤模型２４只，随机分为４组：ＶＥＧＦ反义寡核苷酸治疗（ＡＳＯＤＮ）组、 顺铂治疗（ＤＤＰ）组、联合治疗（ＡＳＯＤＮ＋ＤＤＰ）．组和对照组，每组６只。接种ＭＧ一６３人成骨肉瘤细胞后２４ ｈ内采 用瘤内注射和腹腔给药的方式，以ＶＥＧＦ反义寡核苷酸或（和）顺铂进行治疗；观察各组稞鼠肿瘤的生长情况、裸鼠 的一般情况与生存期。断颈处死裸鼠，测量肿瘤体积大小，称量肿瘤的重量。 结果ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ治疗组、 ＤＤＰ治疗组和联合治疗组裸鼠骨肉瘤的生长均受到不同程度抑制，抑瘤率分别为４４．５６％、５３．６９％和８６．８０％，以 联合治疗组的疗效最佳。 结论ＶＥＧＦ反义寡核苷酸与顺铂联用比单用顺铂可更好地抑制骨肉瘤的生长，两者 联用可发挥协同抗瘤效应。 关键词： 血管内皮生长因子；顺铂；反义寡核苷酸； 骨肉瘤 中图分类号：１１７３８．７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２—７４４４（２００９）Ｏ１—０ｏ３６—０３ ＶＥＧＦ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＤＤＰ Ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ Ｎｕｄｅ Ｍｏｄｅｌ ＦＡＮＧ Ｓｏｎｇ—ｑｉｎｇ，ＺＥＮＧ Ｇｕ—ｑｉｎｇ （Ｄｅｐａｒｔａｍｅｎｔ ｏｆＧｅｎｅｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏＳｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ， Ｈｅｎｇｙａｎｇ，Ｈｕｎａｎ ４２１００１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＶＥＧＦ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｒ／ａｎｄ ＤＤＰ ｏｎ ｔｈｅ ｒｇｏｗｔｈ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｓａｒｅｏｍａ Ｎｕｄｅ ｍｏｄｅ１． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｎｄ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｉｎｔｏ ２４ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｍｏｄｅｌ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ４ ｇｒｏｕｐｓ：ＶＥＧＦ ＡＳＯＤＮ ｇｒｏｕｐ，ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ，ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｇｏｕｐ．Ｔｈｅ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｇｉｖｅｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｔ ２４ ｈｏｕｒｓ ａｆｔｅｒ ｃｅｌｌ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｗｅｉ￣ｔ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅ ｆｏ ｓｕｂｃｕｔａ ｎｅｏｕｓ ｔｕｍｏｒｓ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅ ｉｎ ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ ｇｒｏｕｐ ｗａ．５ ４４．５６％，５３．６９％ｉｎ ｔｈｅ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ。ａｎｄ ８６．８０％ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｇｒｏｕｐ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｔｒｅａｔｄｅ ｗｉｔｈ ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ ａｎｄ ＤＤＰ ｓｈｏｗｅｄ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｈａｎ ｔｈｅ ＶＥＧＦ～ＡＳＯＤＮ ｇｒｏｕｐ ｏｒ ｔｈｅ ＤＤＰ ｇｒｏｕｐ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ ｎｕｄｅ ｍｏｄｅｌ Ｃａｎ ｂｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ＶＥＧＦ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ＤＤＰ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｂｅｔｔｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｃａｎ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｆ ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ ａｎｄ ＤＤＰ ａｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｎ ｕｓｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＶＥＧＦ； Ａｎｆｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｃｓ；ＤＤＰ； ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ 骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤，其死亡率和致 常组织的毒副作用一直是骨肉瘤临床治疗的难题。 残率相当高，化疗药长期应用后的耐受性及其对正 因此，寻找更加积极有效的治疗方法十分必要。 收稿日期：２００８—０６—２Ｏ 基金项目：湖南省卫生厅课题资助项目（４—０４一ＷＳ—Ｂ２００４－０８９）． 通讯作者：３－松清，主任医师，教授，Ｅ—ｍａｉｌ：Ｆａｎｇｓｏｎｇｑｉｎｇ１２３＠１６３．ｃｏｍ ３６ Ｋａｒａｙｉａｎｎａｋｉｓ等¨ 研究表明血管内皮生长因子 （ＶＥＧＦ）与肿瘤的形成、发展、转移和预后密切相 关。有研究针对ＶＥＧＦ设计其反义寡核苷酸，观察 了ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ对骨肉瘤生长的抑制作用 Ｊ。 本研究采用ＶＥＧＦ反义寡核苷酸或（和）顺铂治疗 裸鼠骨肉瘤，探讨ＶＥＧＦ反义寡核苷酸和顺铂单用 或联用对裸鼠骨肉瘤生长的抑制作用，为骨肉瘤的 临床治疗提供实验依据。 １ 材料与方法 １．１细胞和细胞培养 人成骨肉瘤细胞株ＭＧ一６３购自中南大学肿瘤 研究所。用含１０％小牛血清的ＲＰＭＩ一１６４０细胞培 养基，置３７℃、饱和湿度、体积分数为５％的ＣＯ 培 养箱中传代培养。在倒置显微镜下观察细胞生长情 况，取对数生长期细胞用于实验。 １．２反义寡核苷酸的合成 血管内皮生长因子反义寡核苷酸的合成序列参 照李维方等－３ 的设计，针对ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ第３外显 子的单链区按碱基互补原则设计并合成反义寡核苷 酸，反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）的序列：５ 一ＧＣＡ ＧＴＡ ＧＣＴ ＧＣＧ ＣＴＧ ＡＴＡ ＧＴＧ Ｃ一３ ，由上海生工生物工 程公司合成、并进行硫代修饰。 １．３裸鼠骨肉瘤模型的建立 ＢＡＬＣ／Ｃ裸鼠，２４只，雌性，４～６周龄，体重２Ｏ ～２５ ｇ，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，饲养 于ＳＰＦ级无菌饲养室。对数生长期的ＭＧ一６３人成 骨肉瘤细胞，经０．２５％胰酶＋０．０２％ＥＤＴＡ消化 后，加ＰＢＳ洗涤２次，离心，弃上清，制成单细胞悬 液，细胞浓度为２×１０。／ｍＬ。将制备好的细胞悬液 以０．２ ｍｌＪ只接种于ＢＡＬＣ／Ｃ裸鼠一侧背部皮下。 １．４治疗方法 按随机数字表法将２４只ＢＡＬＣ／Ｃ裸鼠随机分 为４组，每组６只，即ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ组、ＤＤＰ组、 联合治疗组和对照组。ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ在接种后２４ ｈ内原位注射，溶于０．２ ｍＬ生理盐水（含ＡＳＯＤＮ ２００ Ｉｘｇ）；ＤＤＰ采用腹腔注射，溶于０．２ ｍＬ生理盐 水（含ＤＤＰ ３ ｍｇ／ｋｇ体重）；对照组采用原位注射配 合腹腔注射等容积的生理盐水；每周２次，连续治疗 ４周。皮下肿瘤开始形成后每隔３天测量１次肿瘤 的长径（ａ）和短径（ｂ），根据公式Ｖ＝１／２ａｂ 计算肿 瘤体积，绘制生长曲线。于治疗４周后处死裸鼠，将 肿瘤完整取下，称瘤重，计算每组瘤重的平均值及治 疗组的抑瘤率。抑瘤率＝（对照组瘤重一治疗组瘤 重）／对照组瘤重×１００％。采用金正均Ｑ值法 判 断化疗药物与反义寡核苷酸联合使用的效果Ｑ＝ Ｅ￣＋ｂ／（Ｅ ＋Ｅｂ—Ｅ ×Ｅｂ），Ｅ ＋ｂ为合并用药的抑制 率，Ｅ 和Ｅ 分别为单用化疗药物和单用反义寡核 苷酸的抑制率。Ｑ＜０．８５表示两药合用有拮抗作 用，Ｑ＞１．１５表示两药合用有协同作用，０．８５≤Ｑ≤ １．１５表示两药合用有相加作用。 １．５统计学处理 采用ＳＳＰＳＩＯ．０软件统计包对数据进行处理，治 疗前后体重的比较行配对￡检验，各组间瘤重比较 行方差分析。 ２ 结 果 ２．１成瘤性 接种ＭＧ一６３人成骨肉瘤细胞后，裸鼠于ｌ周 左右成瘤，实验组及对照组在接种部位均有肿瘤生 长，成瘤率１００％。 ２．２裸鼠的一般情况与生存期 对照组的裸鼠自第３周开始出现食欲逐渐下 降，精神萎靡，体重下降等情况，联合治疗组的裸鼠 则较活泼，毛色较鲜亮。而ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ组与 ＤＤＰ组的裸鼠则介于两者之间。到第４周末所有 动物均存活。第４周末各组裸鼠体重变化见表１。 表１治疗前后裸鼠的体重变化情况（ｇ） ａ：Ｐ＜０．０５，与本组治疗前比较 ２．３肿瘤体积变化 治疗组瘤体的生长速度明显慢于对照组，联合 治疗组表现尤其明显（图１）。 ２．４治疗４周后各组裸鼠瘤重的变化 各组裸鼠瘤重组问经方差分析，差异有统计学 意义（Ｆ＝６８．９０，Ｐ＜０．０１）。经两两比较，治疗组瘤 重明显低于对照组（Ｐ＜０．０１）；而且联合治疗组瘤 重明显低于ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ组和ＤＤＰ组（Ｐ＜ ０．０１）（表２）。 ２．５ ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ对裸鼠骨肉瘤的抑瘤情况 ３７ 经过４周的治疗，从裸鼠的体重、瘤体大小变化 及瘤重可以看出，３个治疗组的裸鼠骨肉瘤瘤重及 生长速度明显低于对照组，其中以联合治疗组的疗 肿瘤体积ｆｃ宣 ９ ８ ７ ６ ５ ４ ３ ２ １ Ｏ 效最为显著，与对照组比较具差异有显著性，且Ｑ 值为１．１７，提示ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ和ＤＤＰ两者合用具 有协同作用。 一对照组 —●一ＶＥＧＦ ＡＳＯＤＮ 组 —－ ＤＤＰ组 —＊一联合治疗掘 ０ ７ １４ ２１ ２８ 接种后Ｅｔ期（无） 图１接种后肿瘤生长曲线图 表２血管内皮生长因子反义寡核苷酸和顺铂对裸鼠骨肉 瘤生长的抑制作用 ａ：Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ，与对照组比较；ｂ：Ｐ＜０．Ｏ１，与ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ组和 ＤＤＰ组比较 ３ 讨 论 过去１Ｏ年间对骨肉瘤的治疗有了很大的发展， 化疗药物的使用明显改善了预后。但传统化疗药物 的毒副作用及耐受性限制了其应用。因此，调整化 疗药物剂量、减少其毒副作用及通过增加选择性来 加大治疗反应已成为抗肿瘤研究的重要方向。已有 研究报道ＡＳＯＤＮ与化疗药物联合用药可显著增强 抑制肿瘤细胞增殖的效果 。ｊ。 本实验通过建立ＢＡＬＣ／Ｃ裸鼠皮下骨肉瘤模 型，观察了ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ与ＤＤＰ单用和联合应用 的抑瘤效果。结果表明，应用ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ与 ＤＤＰ均具有抑瘤作用（Ｐ＜０．０１）。与对照组比较， 治疗组裸鼠相对较活泼，毛色较鲜亮；肿瘤生长缓 慢，体积较小，瘤重较轻，其抑瘤率分别为４４．５６％、 ３８ ５３．６９％和８６．８０％。各治疗组中又以联合治疗组 的疗效最佳，其抑瘤率与单独应用ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ 或ＤＤＰ的抑瘤率比较其差异具有显著性（Ｐ＜０． Ｏ１），提示ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ可增强骨肉瘤细胞对化 疗药物顺铂的敏感性。Ｑ值为１．１７，大于１．１５，提 示两者联用可发挥协同抑瘤效应。在实验中通过观 察裸鼠的体重、一般情况与生存期发现，联合应用 ＶＥＧＦ—ＡＳＯＤＮ与ＤＤＰ对裸鼠无不良影响，也没有 增加ＤＤＰ的毒副作用。由此可见，联合应用ＶＥＧＦ —ＡＳＯＤＮ与ＤＤＰ治疗骨肉瘤，不但有助于克服单 用化疗药物所引起的毒副作用大，容易发生耐药等 缺点，而且有助于解决单用ＡＳＯＤＮ治疗难以完全 抑制肿瘤的生长，且成本较高等问题。其相互作用 的分子机制尚需深人研究。 参考文献： ［１］Ｋａｒａｙｉａｎｎａｋｉｓ ＡＪ，Ｓｙｒｉｇｏｓ ＫｉＮ，Ｐｏｌｙｃｈｒｏｎｉｄｉｓ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｃｉｒ— ｃｕｌａｔｉｎｇ ＶＥＧＦ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｐａ－ ｔｉｅｎｔｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｐａｔｉｅｎｔ ｓｕｒ－ ｖｉｖａｌ，ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｓｕｒｇｅｒｙ［Ｊ］．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ，２００２，２３６：３７— ４２． ［２］ 方松清，曾谷清，刘 彦．ＶＥＧＦ反义寡核苷酸抑制裸 鼠骨肉瘤生长的实验研究［Ｊ］．南华大学学报・医学 版，２００６，３４（１）：２１—２３． ［３］ 李维方，张光霁，朱诚，等．ＶＥＧＦ反义寡核苷酸抑制 ｃ６胶质细胞ＶＥＧＦ表达的作用和效果［Ｊ］．第二军医 大学学报，２００２，２３（２）：１５６—１５８． ［４］ 金正均．合并用药中的相加［Ｊ］．中国药理学报，１９８０， １（２）：７Ｏ一７６． ［５］Ｙａｎｇ Ｙ，Ｄｕ ＱＹ，Ｗａｎｇ ＳＱ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ ｏｆ ａｎ ｎａｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉ— ｇｏｄｅｏｘｙｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏ ｈＴＥＲＴ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇｓ ｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００３，１１（１２ ）：７１９—７２１． ［６］Ｈｕａｎｇ Ｗ，Ｚｈａｎｇ ＹＺ，Ｚｈｏｕ ＪＦ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎａｔｉ— ｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｋｌ／２ ｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｋ５６２ ｃｅｌｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＤＤＰ［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｓｈｉ Ｙａｎ Ｘｕｅ Ｙｅ Ｘｕｅ Ｚａ Ｚｈｉ，２００４，１２（５）：５６３—５６７． ［７］Ｌｉ—Ｃｈｅｎｇ Ｄａｉ，Ｘｉａｎｇ Ｗａｎｇ，Ｘｉｎｇ Ｙａｏ，ｅｔ ａ１．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｍｉｄｋｉｎｅ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００７，１３（１３）： １９８９—１９９４． （此文编辑朱雯霞）