辣椒CaCBFIA基因的克隆及非生物胁迫下表达分析

d〇i：10. 15933/j. cnki. 1004-3268.2016. 12.022

辣椒基因的克隆及非生物胁迫下表达分析

魏小春\\李艳2,姚秋菊\\原玉香\\赵艳艳\\王志勇\\

姜俊2,段俊枝3,蒋武生\\张晓伟〃

(1.河南省农业科学院园艺研究所，河南郑州450002; 2.驻马店市农业科学院，河南驻马店463000;

3.河南省农业科学院农业经济与信息研究所，河南郑州450002)

摘要：为揭示CaCfiWA基因在辣椒抗逆机制中发挥的功能，对辣椒CaCfiWA基因进行克隆与分 析。以豫椒101为材料，根据参考基因组序列设计引物，通过PCR技术从辣椒基因组cDNA中获 得CBF基因CaCfiWA。经生物信息学分析，该基因具有一个完整的0RF(471 bP)，编码156个氨 基酸。

编码的蛋白质包含保守的AP2DNA结合域。对其亚细胞定位、跨膜结构进行分

析，预测其定位在叶绿体中，存在跨膜结构。荧光定量P C R检测结果表明，低温、高温和盐胁迫均 可诱导CaCfi凡M基因的表达，其表达量在迅速达到峰值后又降低，说明CaCfi凡M是一个逆境胁迫 快速响应基因，推测其在辣椒抗逆机制中起着重要的作用。关键词：辣椒；CBF基因；基因克隆；非生物胁迫；表达分析中图分类号：S1.3

文献标志码：A

文章编号：1004 -3268(2016)12 -0110 -06

Cloning and Expression Analysis of CaCBFIA Gene from

Capsicum annuum L. under Abiotic Stress

WEI Xiaochun1 , LI Yan2,YA0 Qiuju1 ,YUAN Yuxiang1 ,ZHA0 Yanyan1 ,WANG Zhiyong1 ,

JIANG Jun2,DUAN Junzhi3 JIANG Wusheng1 ,ZHANG Xiaowei1'

(1. Institute of Horticulture , Henan Academy of Agricultural Sciences , Zhengzhou 450002 , China ；

2. Zhumadian Institute of Agricultural Sciences , Zhumadian 463000 , China ；

3. Institute of Agricultural Economy and Information , Henan Academy of Agricultural Sciences , Zhengzhou 450002 , China)

Abstract： To reveal the roles of CaCBFIA gene played in pepper, the CaCBFIA gene was cloned and analyzed. According to the CBF gene sequence from Capsicum annuum genome, the primer was designed. Yujiao 101 was taken as material and CaCBFIA was acquired from the genome of pepper by PCR. The

bioinformatics analysis results indicated that the gene possessed complete ORF with length of 471 bp, encoding 156 amino acids. Protein encoded by that protein encoded by

CaCBFIA gene in pepper contained conservative AP2 DNA

binding domain. Besides,the subcellular localization and membrane structure were analyzedJt was predicted

CaCBFIA was located in chloroplasts, and contained transmembrane structure.

Furthermore,the results by fluorescence quantitative PCR showed that cold,high temperature and salt stress

CaCBFIA gene, the expression level of which was decreased rapidly after

peak point. These could provide some indication that CaCBFIA was rapid response gene, which played

could induce the expression of

Key words ： Capsicum annuum L. ； CBF gene; gene cloning ； abiotic stress; expression analysis *

收稿日期=2016 -07 -20基金项目：国家大宗蔬菜产业技术体系豫北综合试验站项目（CARS-25 - G - 27);河南省重大科技专项（151100110400) 作者简介:魏小春（1983 -)，男，河南项城人，助理研究员，博士，主要从事植物生理与分子生物学研究。

E - mail：jweixiaochun@ 126. com

important roles in the resistance mechanisms of pepper.

*通讯作者：张晓伟（1965 -)，男，河南平舆人，研究员，硕士，主要从事蔬菜育种与分子生物学研究。网络出版时间=2016 - 11 -25 14： 24： 33网络出版地址：http ://www. cnki. net/kcms/detail/41. 1092. S. 20161125. 1424. 028. html

第12期魏小春等：辣椒基因的克隆及非生物胁迫下表达分析111

^^(Capsicum annuurn L.)原产于中南美洲热

带雨林地区的墨西哥、秘鲁等地，属茄科辣椒属植 物，果实内含有丰富的维生素C、糖类和辣椒素等营 养物质。辣椒在我国各地普遍栽培，但在整个生育 过程中，从播种到果实收获，其会时时刻刻受到干 旱、低温、高温等非生物胁迫，轻者使植物生长发育 受阻，重者导致植株死亡。

植物在应对非生物胁迫的过程中通常会发生一 系列的生理生化反应，并且形成了一定的胁迫防御 机制[1]，胁迫防御机制主要是通过防御反应基因的 转录激活与抑制发生作用的[2]。在防御反应基因 的转录中，转录因子起着重要的作用。转录因 子通过转录功能区域与基因启动子区域中的顺 式作用元件结合，从而来基因的表达。当然，一

0.093 6 呂/1^411值

1.2方法

为

5.46。

1.2.1辣椒苗的准备供试辣椒种子用纱布包好， 先在55 °C的热水中温汤浸种20 mm,然后室温条件 下充分吸水6 ~ 8

h,播于营养钵（6 cm X 8 cm)中，

每穴1~2粒种子。待子叶出土后放于光照强度为 300 ~600 |xmol/(m2 • s)的培养架上进行培养，生长 温度控制在25 °C/18 °C (昼/夜），出苗后浇1/2营 养液，每钵留壮苗1株，长至四叶一心时转苗至大营 养钵（10 cm X 10 cm)中。当幼苗第5片真叶展开时 移人人工气候箱进行处理。

1.2.2材料处理低温处理：当植株6 ~8片真叶 展平时，将穴盘放人预先降温到4 °C (昼）/0 °C (夜）的光照培养箱内进行低温处理，光照强度为 160 |xmol/(m2 • s)、光周期为 12 h 光/12 h 暗。高 温处理：当植株6 ~8片真叶展平时进行高温处理， 控制昼/夜温度为（45 ±2)°C/(35 ±2)°C。盐处理： 设置CK (不加NaCl)和加NaCl 200 mmol/L 2个处 理。每个处理重复3次，每个重复10株。每处理的 材料数30株，未处理材料为对照。处理时间为0、 6、12、24、48、96 h。取样后立即浸人液氮中，并放人 -80 °C超低温冰箱保存。

1.2. 3 辣椒总RNA提取和cDNA第一链合成总

些转录因子其自身也受诱导，改变特定转录因 子的表达条件会使植物的胁迫抗性发生很大变 化[3]。CBF基因属于AP2/EREBP基因家族，是一 种受逆境特异诱导表达的转录因子，可激活下游多 个效应基因的表达，从而提高植物对低温、干旱等多 种逆境胁迫的抗性[4_5]。

目前，辣椒中功能尚未明确。为此， 对辣椒基因进行生物信息学分析，同时， 利用荧光定量PCR技术研究低温、高温和盐胁迫与

基因表达量之间的关系，以期从一定程度

上揭示该基因的分子功能。

1材料和方法

1.1材料

辣椒材料豫椒101，由河南省农业科学院园艺 研究所蔬菜育种课题组繁育。完全营养液为霍格兰- 阿农配方。基质有机质、速效氮、速效钾、速效磷的 含量分别为 219 g/kg、l. 765 9 g/kg、l. 730 g/kg、

表

RNA的提取采用TRIZOL法（USA)。cDNA第一链

合成采用Thermo Scientific公司cDNA合成试剂盒 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit。

1.2.4基因引物设计与合成根据辣椒基因组数 :HI|^(http://peppergenome.snu.ac.kr/)*

CBFS 因（CA03g15650)的序列，在5'UTR及3'UTR设计 引物（表1 )，委托Invitrogen生物工程技术服务有限

表

达

检

测

所

用

引

物

公司合成。

其

1

辣椒基因克隆及

CBFF

CBFRqCBFF135qCBFR339cACTINF228cACTINR384

1.2.5

引物名称

引物序列（5'— 3f)

GTGGGTTTGTGAAGTAAGAGAACGTAAAATTAAAGGAGGGAGTATGAGGCTGTCGAGTCTTTCA GGTGG A GGTA GC GTT AGTTATTGTCAGCAACTGGGATGGGTCTCAAACATAATCTGGGT

基因cDNA全长克隆以第一链

扩增cDNA全长扩增cDNA全长检检

测测

的的

表表

达达

用途

片段大小/bP

596205

扩增内参基因扩增内参基因

157

CaCfi凡M

cDNA为模板，用CBF基因引物进行PCR扩增。 PCR 反应条件为：95 °C 5 min;95 °C 30 s， 〇C 1 min ,72 °C延伸1 min,反应35个循环。

PCR反应产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测后回

收，回收片段与pMD19 - T载体（TaKaRa公司）连 接，热击法转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，挑选阳 性单克隆送公司测序，得到目的片段序列。PCR酶

112

河南农业科学第45卷

试剂（SeqAmp™ DNA Polymerase)购自 Clontech 公 司，Marker DL2000购自北京鼎国昌盛生物技术有限 责任公司。

1.2.6 序列分析利用

2结果与分析

以辣椒cDNA第1条链为模板，用引物CBFF/

2.1 辣椒基因的克隆

ClustalX 2

软件对克隆的

基因的核苷酸及其编码氨基酸序列与其

他物种的对座序列进行比对分析;根据所得的cDNA 序列，利用NCBI的

CBFR扩增出600 bp左右的目的片段（图1)，将目

的片段回收后连接转化，挑取阳性克隆用引物检测 后测序。测序结果显示，该片段与辣椒基因组数据 库中目的片段完全一致，大小为596 bP，该基因从起 始密码子ATG到终止密码子TAG具有一个完整的

Blastp分析工具对基因所编码 的氨基酸进行同源序列比对，并结合MEGA 4.0构 建进化树；利用软件 ProtParam ( http ://web. expasy. org/protparam/ )对基因编码的氨基酸组 分、分子量和等电点进行分析；利用软件ProtScale (http://web. expasy. org/protscale/)分析氣基酸序

ORF(471 bp)，编码156个氨基酸。

列的亲/疏水性；利用软件30?]\\/[八（11即8://叩83-

prabL ibcp. fr/cgi-bin/secpred_sopma. pi)对蛋白质二 级结构进行预测；利用软件BaCelLo ( http ://gpcr2. biocomp, unibo. it/bacello/pred. htm )进行亚细胞定

位的预测a

1.2.7实时荧光定量分析对上述高温、低温及盐 胁迫处理后的辣椒叶片提取总RNA，反转录成cDNAq 定量PCR反应体系为20. 0 pL，含有10. 0

2 x

图1 辣

椒

M. DL2000

基

因

PCR扩增

SYBR® Premix Ex Taqm (T\\i RNaseH Plus), 2.0 cDNA，上、下游引物（qCBFF135 及 qCBFR339)各1 pL

(引物浓度l〇 Fim0l/L)，6

2.2辣椒CaCBFhl基因编码氨基酸序列的同源 性分析

对辣椒基因编码的氨基酸序列在

ddH20。运行程序为：

95 °C 预变性 30 s;95 °C 变性 5 s，55 °C 退火 30 s，72 °C 延伸60 s，40次循环。每个样品重复3次③

以Ac‘如基闪为内参，扩增引物为cACTINF228 和cACTINR384。实时荧光定量PCR仪为罗氏公司

LightCyder@96。采用2 —AACT法计算基因相对表

NCBI中进行Blastp比对分析，结果显示其蛋白质含

有AP2/EREBP基因家族保守的AP2 DNA结合域

(图2)s将辣椒基因编码的氨基酸序列 与其他物种的CBF基因编码的氨基酸序列进行比 对，结果表明，辣椒

达量[#]9:

CBF1A氨基酸与其他作物CBF 氨基酸有高度的相似性，属于CBF家族（图3)。

Putative conserved domains have been detected,click on the image below for datailed results.

卜… ……5p……7丨5……1Q0……1?5 , …1$0 06

Query seq.Superfamili娘 AP2 superfamily-\")

图2

Populus Hevea Morns Betula

Mangifera Capsicuir pepper Solanum

基因编码蛋白的保守结构域分析

42

一

__________________------ - --------- -------—MLikSRNPElKAGHEKFiaiTIfflPVTfKQVraRMSGKWC^ViaiPMiVFFQYSiSLPFAT- - -HSCSLHYPESSTLS|!TCSAL- -BANLSDilWLLASSYPKKlAGRKKPRETRHPIYRGVHRMNSGICWVClIREP mAPCSSSlYNQYSS---¥SDLWTPEASDSMSPSDS<3G-RiMNPSI)EE\\rT/LASISCPKICEAGHKKPKETRHPT/YRGVRRRNSGKWVCE\\TREPm|vPS------QYS-------------------^|SESG——AMHLSiiiilRLASRNPKERAGHKKFEETHHPVYlGVHRRNSGEWVCEVREP^FFSSFSiPHPYSSGPWSPGSDLFTASSFl!SDGNS R1GK PSD|bVLL AAS YP1XH AGITKPRETHIIPVYRGVRRroiS GKWVCITvTRE P MNIF1SYYSDFLTES-S©SSIYSPNRAIPSDEET/ILASiraPKKPAGRKKPRETRHPVYRG\\rRKRNSGKW\\TCEVREP

SIB87

659179

86

MKIFETYYSDFLILT-

ESSSSSSSSSSSBHIirLASNNPICPPAGHKKFRETRHPrYEGIRMRNSG

：

12916916814417515572163

PopulusHeveaMoms Betula Mangifera Capsicum pepper Solanum

NKKTHIWLGTFPTAEMAARAHDYAAIALRGHS'ltiliNFADSAWBLPVPASPEPKDIQKAASBAjyBAPHPV----DMAED-------TGEKP,NEQSHIWLGTPPTAKMAAHAHDVAAIALEGNSACLHPAESAWHLPVPASGTAKDIQHTAA1AAEEPRPA----BSKAV-------1DRQPNKKGHIWLGTPPTV1MAARAHDVAALALEGHMACLNPAESAWHLPVPTSTDAKDIQKAAAEAABAPHPT----QESGG---LK^|sEEM'NKKSBIWL.GTFPTAEMAARAHDVAAIALEG.RSACLNFAESAW1LPVPASSETKDIQKAA AIBA]---- '------------------------------------MA AHAHDVfl A LALRGHS ACLN FAD STWH LPIP ASSN Siroi QKA AAfiAVis PR P --------iSlaVSCSBSADSSSPQTP

HHswtnfi

***#*#*#*#

NEKS1IWLGTPPT,

MAARAHSVAALAALALBGRS.S ：ASLNFAES S AWB LPVP ASSS AKDIQKA A A«A AGGPR P E-------G CVGGELMETGjEGEK AA

'TEE19ARAHDVAALALBGRSACLKPAOSSW]... IfLPVPASRXAESlRKAAAiAAM.....AFQPE-------G 寧----------F5G|LEQENK

j

恤

NKKSHIWLGTPPTAKMAARAHDVAALALHGHSACLNPACSAWBLPIPASSNSN|lQKAAABAAHIF^BSS3SElSsiEV£G3)~SDN£TPETP

S

Populus

HeveaMornsBetulaMangiferaCapsicumpepperSolanum

----------------------------------------------------- 192JTTAEAGBIVP-----------YMODS AVP<3MP G LL AMMJ^GML L PPPH|<3Ga<3|) - (SWfflNM EN liAfH P LWSPSI

WTTESAPSDVF-----------YMDESAVFAMP G LLASMABGMLL PFP^VAG S G-GEfl -GEMDAAfVS LWSFSI.... 231

----------------------------------------------------- 230DAAVAEsiDVP-----------PMDElAVPGMPGLLTMMA®GMLLPPPl®l^|HD--YSSIlDiilAYANVSLWSYSD

------------------ 2〇2--------------SESLP------------PMDESAVPGMPGLHIHMABGMLLPPPY^VGDDDCYSGDVMEAHAEVSLWSYSI

，…………… 234gEETTMSDlVF-----------FMDE B AVFGMP G LL AMMABGML LPPPReEIDGaj-EAJI----------J^GEMSLWSYSI

ESSSSTPESMF-----------FMDEE AL F CM P G LL THMA：1G LKL PPP〇| A3| IG----------OHVETAjS；-----------------------iiPLWSYsr-------------------------------------- 215

156SS V P PMNiS V P® S RP - PHlJES ALP PKF G LL AHMAJSW LTL PPP QC GE F G----------DH-VEVDIS YH ；P LWMYSVL SPVIYITLGA7PLLSTPLHY

IN A FFMN^ VCISSFL Pulnri ALF FHP G LI AMMjJa LML PPFdi AlMG----------iHYvi_LIAYMTLWNYSI----------------------------------------------------- 228

图3辣椒编码氨基酸序列与其他作物

CBF编码氨基酸序列比对

第12期魏小春等：辣椒

M

基因的克隆及非生物胁迫下表达分析

113

2.3辣椒CaCBFIA蛋白理化性质的预测

利用ProtParam软件预测辣椒CaCBFIA蛋白分 子质量为17.058 ku，理论等电点为4. 29，分子式为 cW5 H丨m Nm 〇236 该蛋白质中含量最高的氨基酸

为Ser，相对含量达到了 12.2%，含量较低的氨基酸 有

蛋白质的多肽链通过折叠、螺旋和卷曲等二级 结构形成比较稳定的空间结构，利用软件分析

CaCBFIA的二级结构，发现多个氨基酸参与a -螺 旋、无规则卷曲和延伸链等二级结构的形成，其中 a-螺旋、延伸链、P -折叠和无规则卷曲分别占 42.95%、12. 18%、7. 05% 和 37. 82% (图 5)。这 4 个结构是构成CaCBFIA蛋白的基本结构。

CyS、HiS和Trp，共计为1.2%，不含有Pyl和Sec。

其脂肪系数为77. 63,疏水性平均值为0.043。说明 该蛋白质为疏水性蛋白

2.4辣椒CaCBFIA蛋白亚细胞定位、二级结构及 疏水性分析

利用BaCelL。软件对辣椒CaCBFIA进行亚细 胞定位的预测，结果表明其定位在叶绿体中（图4) 9

BaCelLo

Results

Predictor chosen: Plants

图4辣椒CaCBFIA蛋白亚细胞定位预测

10

MARAHD VAAL ALRGRS ACLNF AD S TWKLP IP AS SNSKDIQK AAAE AVE SFEP SE SEG VSGE S AD S S SPQ TPE S VFFMNEE VPE SEFFMDEE ALFFMPGLL AMAEGL TLPPPQCGEFGDHVE VD S YMPL WWYS VL SF VI

ehhhhhhe ehhhlihhh

h、e、t和c分

图5

I

20

I

30

I

40

I

50

I

60

I

70

!

hhhhhhhhhhhhhttccheeeeccccccccccccccchhhhhhhhhhhhhcccccccccccccccccccc

YITLGAVFLLSTFLNY

cccheeeehtcccccheeehhhhhhhhhhhhhhhhttcccccccccccccceeeetttttthhhhhhhhe

别代表

a -螺

旋、延伸链、^ -转角和无规则卷曲

辣椒CaCBFIA蛋白二级结构预测

采用ProtScale对CaCBFIA蛋白的疏水性进行

分析（图6)，整体来看，亲水性氨基酸和疏水性氨基 酸在整个蛋白质中分布不均匀，有明显的疏水区。

2.5辣椒CaCBFIA蛋白进化树分析

使用NCBI中Blastp工具对辣椒CaCBFl A氨基 酸序列进行同源性检索，对检索到的数据再利用 MEGA 4.0软件构建系统进化树，结果表明，辣椒

CaCBFIA与茄属（Sokrm一植物CBF1亲缘关系最 近，而与杨属葡萄属（F—)植物等亲缘 关系较远（图7) a

图6辣椒CaCBFIA蛋白亲疏水性预测

0.05

图7

辣椒及其他物种CBF蛋白进化树分析

114

河南农业科学第45卷

2.6辣椒CaCBWA基因在不同逆境胁迫下的表 达分析

利用荧光定量PCR仪分别检测辣椒CaCBRM 在低温胁迫、高温胁迫和盐胁迫下的相对表达量。 结果表明，

基因在低温胁迫后表达量迅速

升高后又下降，在12 h时表达量迅速达到峰值，约 为对照的135倍，24 h后仅为对照的28倍（图8a);

CaCBFM基因在高温胁迫12 h后表达量迅速升为

对照的172倍，在24 h时迅速恢复正常，总体上表 达量先逐渐升高达到峰值后下降，随着处理时间的 延长又呈逐渐上升的趋势（图8b);CaCBFM基因 在盐胁迫后表达量逐渐升高后又逐渐下降，在盐胁 迫12 h时表达量达到峰值，约为对照的20倍（图8c) Q

120.0

80..0

40..1 01

.

60

20 80 40 4 3 0

211

0 5 0

5

0.5

.0

0.0

0 6 12 24 48 96

低温胁迫处理时间/h

图8

0 6 12 24 48 96高温胁迫处理时间/h

逆境胁迫下基因在叶片中的表达情况

6

盐胁迫处理时间

12 24 48 96

/h

3 结论与讨论

AP2/EREBP是一种受逆境特异诱导的转录因

下，该基因诱导差异不显著[14]e将南极发草

基因转到水稻中，逆境胁迫后分析表明，该

基因大大提升了转基因植株耐低温胁迫能力，而对 干旱及盐胁迫作用不大[15]。

本试验通过同源克隆的方法从辣椒基因组中克 隆到CaCBFM基因（CA〇3gl565〇)，并利用生物信 息学软件对其编码氨基酸序列进行了分析，该基因 具有一个完整的〇RF(471 bp)，编码156个氨基酸。

编码的蛋白质包含保守的AP2 DNA结合

域。对其亚细胞定位、跨膜结构进行分析，预测其定 位在叶绿体中，存在跨膜结构。进一步研究了辣椒

CaCBFM基因对低温胁迫、高温胁迫和盐胁迫的响

子，可激活下游多个效应基因的表达M。CBF基因 属于AP2/EREBP基因家族，具有AP2 DNA结合 域，该结合域是植物基因特有的结合域[7]。CRT/

DRE是高等植物抗逆相关基因中的一种顺式作用

因子，CBF基因中的AP2 DNA结合域能够识别

CRT/DRE顺式作用元件，并抗逆相关功能基因

的表达，从而提高植物对环境的耐受性。

Medina等[8]研究发现，拟南芥CBF基因家族成

员也CBF7、也CBF2和也基因只对低温产生了 响应，对干旱和ABA没有反应#对辣椒CaCBRM 和

研

究

发

现

，低温情况下，这2个基因受

诱导表达;而如果长期持续低温，这2个基因会一直 表达，

上调10〜15倍[91 ^

秦红霞等[1°]研究了银新杨转录因子沿 的表达模式，发现其表达受低温、十旱和盐胁迫的诱 导。通过转录组分析及突变试验研究低温胁迫下拟

南芥基因_达情况，结果表明，CSF2能够诱导44个 基因上调，其中有25个基因至少上调15倍[11]。

Wang等[12]研究柠条锦鸡儿dCBF基因，发现其在

应。对胁迫环境下其相对表达量的分析表明，随着 胁迫处理时间的延长，其_达量呈现先升高后下降 的趋势。由于CBF转录因子在许多与抗逆相关功 能基因的表达中发挥重要作用，因此，利用CBF基 因增强植物抗逆性成为改良植物的重要途径。

参考文献：

低温、干旱、高盐及ABA等逆境条件下表达量上调； 在烟草中超量表达该基因，与非转基因植株相比，其 提高了植株的耐盐性和渗透力。周洲等™对毛白 杨转录

因

乎

在逆境下的表达模式进行分析

发现，其在低温和干旱胁迫下表达量有显著变化，而 对高盐和ABA胁迫没有反应s将甜椒 /加…讓）胁迫下，

基因转到烟草中，结果表明，在冷 急速上调；而在盐胁迫及干旱胁迫

[1 ] Glazebrook J. Genes controlling expression of defense re­

sponses in Arabidopsis [ J] . Plant Biology, 2001,4 (4) * 301-308.

[2] Rushton P J，Somssich I E. Transcriptional control of plant

genes responsive to pathogens[ j ], Plant Biology, 1998 ,4 ： 311-315.

[3 ] Chen W , Provart N J , Glazebrook J , et al. Expression pro­

file matrix of Arabidopsis transcription factor genes sug­gests their putative functions in response to environmental sliesses[J].Th« Plant Cell,2002,3 (14) ：559-574.

[4] Yang T W，Zhang L J，Zhang T G，祝 aZ. Transcriptional

regulation network of cold-responsive genes in higher

第12期魏小春等：辣椒

CaCfifM基因的克隆及非生物胁迫下表达分析

报，2005,21(6) :906-910.

[11]

115

plants [ J ]. Plant Science ,2005,169 ： 987 -995.

[5]

Thomashow M F. Molecular basis of plant cold acclima­tion ： Insights gained from studying the CBF cold response pathway [ J ] . Plant Physiol ,2010,1(2) ： 571 -577.

[6]

Livak K J,Schmittgen T D. Analysis of relative gene ex­pression data using real-time quantitative PCR and the 2_aact method[J]. Methods,2001,25(4) ：402408.

[7]

Sieber A N,Longin C F, Leiser W

[12]

Vogel J T,Zarka D G,Van Buskirk H A,et al. Roles of the CBF2 and ZAT12 transcription factors in configuring the low temperature transcriptome of Arabidopsis [ J ]. Plant J,2005 ,41(2) ：195-211.

Wang X M,Dong J,Liu Y ,et al. A novel dehydration-re­sponsive element-binding protein from Caragana korshin-

h, et al. Copy number

skii is involved in the response to multiple abiotic stres­

ses and enhances stress tolerance in transgenic tobacco [J],Plant Mol Biol Rep ,2010 ,28 (4) ：6-675.

variation of CBF-A14 at the Fr-A2 locus determines frost tolerance in winter durum wheat [ J ] . Theor Appl Genet, 2016,129(5) :1-11.

[8]

Medina J,Bargues M,Terol ],et al. The Arabidopsis CBF gene family is composed of three genes encoding AP2 do­main-containing proteins whose expression is regulated by low temperature but not by abscisic acid or dehydration [J] . Plant Physiol, 1999,119(2) ；463 469.

[9]

Kim S,An C S,Hong Y

[14]

[13] 周洲，李永丽.毛白杨转录因子的表达模式

分析[】].林业科学，2010,46(4):58-63.

Yang S,Tang X F,Ma N

al. Heterology expression

of the sweet pepper CBF3 gene confers elevated toler­ance to chilling stress in transgenic tobacco [ J ] . J Plant Physiol,2011,168(15) ：1804-1812.

[15]

Byuna M Y,Leeb J,Cuia hH,et al. Constitutive expres­sion of DaCBF7, an antarctic vascular plant Deschampsia

al. Cold-inducible transcrip­

annuum L.)

tion factor, CaC5F,is associated with a homeodomain leu­cine zipper protein in hot pepper( Capsicum [J] . Mol Cells,2004,18(3) ：300-308.

[10] 秦红霞，贾志平，张海超，等.银新杨中与DRE元件结

antarctica CBF homolog, resulted in improved cold toler­

ance in transgenic rice plants [ J ] . Plant Science , 2015 , 236：61-74.

合的转录因子的克隆及鉴定分析[J].生物工程学

<

(上接第104页）

[4] 陈旭，刘晓飞，叶辉.云南主要有害实蝇种类及区划[J].

[13] 张淑颖，肖春，李正跃，等.芒果挥发物对桔小实蝇成

虫的引诱作用[J].云南农业大学学报，2007,22(5):

659-6.

[14] 梁帆，梁广勤，赵菊鹏，等.实蝇引诱物的研究概况[J].

生态学报,2010,30(3):717-725.

[5] 刘莉，赵家升.云南柯街地区桔小实蝇种群动态及主

要影响因子分析[J].河南农业科学,2010(6) :87-91.

[6] 太红坤，李正跃，罗红英，等.颜色和糖醋液对番石榴

生物灾害科学,2014,37(3) :204-210.

[15] 袁盛勇，孔琼，薛春丽，等.几种果实香精诱集桔小实

实蝇引诱效果[J].安黴农业科学，2009,37 ( 14):

81-82.

[7] 陆永跃，曾玲，梁广文，等.对性引诱剂监测桔小实蝇

蝇成虫的效果[J].中国南方果树，2015，44 ( 1 ):

34-35.

[16] 太红坤，李正跃，蒋小龙，等.甲基丁香酚与糖醋液对

雄成虫技术的改进[J ].昆虫知识，2006，43 ( 1 ):

123-126.

[8] 刘奎，钟义海，卢辉，等.几种诱剂对杧果园桔小实蝇

番石榴实蝇的引诱效果[J].昆虫知识，2010,47(1):

105-109.

[17] 邱飞，冯光春，黄庆文，等.5种引诱剂诱集实蝇类害

的引诱作用测定[J].中国南方果树，2010,39(4):

46.

[9] 李安国，袁辉，黄超艳，等.柑桔小实蝇监测与防控技

虫比较试验[1].南方园艺，2014,25(2):16-18.

[18] 管云.几种实蝇引诱剂的田间诱虫活性评价[D].昆

明：云南农业大学，2010.

[19] 庄剑隆，赖洞森，黄强，等.几种物质对橋小实蝇的引

诱力测定[】].华东昆虫学报，2006，15(2):99-102.

[20]

Ma Y F,Xiao C. Push-pull effects of three plant secondary metabolites on oviposition of the potato tuber moth., Phthori-

术研究[】].现代农业科技，2011(12):186-187.

[10] 王琳，潘志萍.简述引诱剂在实蝇防治中的作用[J].

环境昆虫学报,2011,33( 1) :117-121.

[11] 孙文，伍苏然，袁盛勇，等.糖酒醋液对甲基丁香酚引

诱桔小实蝇成虫效果的影响[J].云南农业大学学 报，2009,24(6) :809-813.

[12] 金菊，阮赞誉，黄珍富，等.莲雾果实挥发物对橋小实

[21]

maea operculella [ J ]. Journal of Insect Science, 2013,

13：128.

Shelton A M , Badenes-perez F R. Concepts and applica­tions of trap cropping in pest management [ J ] . Annual Review of Entomology ,2006,51 ：285-308.

蝇的引诱作用[J].华南农业大学学报，2015,36(3):

71-77.