２０１３年４月 中国比较医学杂志 ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ａｐｒｉｌ，２０１３ 第２３卷第４期 Ｖｏ１．２３ Ｎｏ．４ 小鼠组蛋白去乙酰化酶２多肽抗血清的制备 朱 华，梁 良，盛树力，黄 澜，徐艳峰，秦 川 （卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室， 中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，北京１０００２１） 【摘要】 目的利用人工合成小鼠组蛋白去乙酰化酶２（ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｅｅｔｙｌａｓｅ ２，ＨＤＡＣ２）多肽制备特异性抗 ＨＤＡＣ２抗血清，用于相关疾病的体内外诊断。方法 根据ＨＤＡＣ２基因编码的氨基酸序列合成多肽，与载体偶联 后免疫动物，所制备的抗血清用ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ及免疫组织化学方法鉴定。结果 ＥＬＩＳＡ检测表明所制备的 抗血清可同多肽抗原发生阳性反应，效价１：４ ０００；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果显示抗血清可与多肽抗原及ＡＰＰ／ＰＳＩ转基因 小鼠的脑组织发生反应；免疫血清ｌ：１００，１：２００，１：４００，１：８００四个稀释度均能与小鼠脑组织中的ＨＤＡＣ２反应。 结论所制备的多肽抗血清可识别组织及血清中的ＨＤＡＣ２，可应用于相关领域的体内外研究。 【关键词】组蛋白去乙酰化酶２；多肽；抗体 【中图分类号】Ｒ３３ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７１－７８５６（２０１３）０４－００１５－０４ ｄｏｉ：１０．３９６９．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１．７８５６．２０１３．ＯＯ４．ＯＯ４ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ２ ＺＨＵＡ Ｈｕａ，ＬＩＡＮＧ ｌｉａｎｇ，ＳＨＥＮＧ Ｓｈｕ－ｌｉ，ＨＵＡＮＧ Ｌａｎ，ＸＶ Ｙａｎ・ｆｅｎｇ，ＱＩＮ Ｃｈｕａｎ （Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ；Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ， Ｓｔａｔｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＭＳ）＆Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ（ＰＵＭＣ），Ｂｅｉｊｉｎｇｌ０００２１，Ｃｈｉｎａ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｐｏｌｙｅｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｍｏｕｓｅ ＨＤＡＣ２ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｉｔｓ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎ ａｎｔｉ－ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｉｈｔ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＨＤＡＣ２ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗａｓ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）ａｎｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｒｂａｂｉｔｓ．Ｓａｒａ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＥＬＩＳＡ，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ＥＬＩＳＡ ｗａｓ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ａｓ ｈｉｓｈ ａ８ １：４ ０００．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＡＰＰ／ＰＳ１ ｍｉｃｅ ａｎｄ ＨＤＡＣ２ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｎｄ ａｔ ８０ ｋＤ ｗｈｅｎ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｇｏｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔ ｗｉｔｈ ＡＰＰ／ＰＳ１ ｍｉｃｅ ｂｒａｉｎ ａｔ ｔｉｔｅｒｓ ｏｆ １：１００，１：２００，１：４００，ａｎｄ １：８００．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｈａｖｅ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ＨＤＡＣ２ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ，ａｎｄ ｍａｙ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｅｅｔｙｌａｓｅ ２；Ｐｅｐｔｉｄｅ；Ａｎｔｉｂｏｄｙ 阿尔茨海默病（ＡＤ）是痴呆的主要类型，临床 出现神经纤维缠结（ＮＦＴ）和胞外淀粉样蛋白沉淀形 表现为记忆和认知的退化，其主要病理特征是胞内 成老年斑（ＳＰ）。ＡＤ的致病机理仍不明确，目前比 ［基金项目］协和医学院研究生创新基金。 【作者简介】朱华，剐主任技师，研究方向：病理与病理生理学。Ｅ・ｍａｉｌ：ｚｈｕｈ＠ｃｎｉｌａｓ．ｏｒｇ。 ［通讯作者】秦川，教授，博士生导师。Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｈｕａｎｑｉｎ＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ。 １６ 中国比较医学杂志２０１３年４月第２３卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ ＣｏｍｐＭｅｄ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏ１．２３．Ｎｏ．４ 较流行的学说是８淀粉样蛋白级联假说…。表观 １．３免疫动物 遗传学修饰为研究ＡＤ开辟了新的途径，其中最受 实验用新西兰大白兔１只，购自中国药品生物 关注的是ＤＮＡ甲基化和组蛋白修饰 ，组蛋白酰 制品检定所动物中心【ＳＣＸＫ（京）１１－００－００１０】，体重 基化状态由组蛋白乙酰化酶（ＨＡＴ）和组蛋白去乙 约３ ｋｇ。实验在本所进行【ＳＹＸＫ（京）２０１Ｏ一 酰化酶（ｈｉｓｔｏｎｅｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ、，ＨＤＡＣ）催化，组蛋白酰００３０】。取１ ｍＬ偶联好的多肽加等量弗氏完全佐 基化修饰在学习和记忆功能中的作用如何？在进 剂（Ｓｉｇｍａ，货号Ｆ５５０６），充分乳化后在动物背部皮 行相关研究时无论是在细胞水平还是在整体水平， 内多点注射，每只２ ｍＬ。以后每隔３周用弗氏不完 都需要大量ＨＤＡＣ的抗体来进行检测。本文采用 全佐剂（Ｓｉｇｍａ，货号０５６Ｋ８９０８）与多肽乳化后免疫 合成肽制备ＨＤＡＣ２抗血清，检测了其特异性和在 动物，共３次。第３次免疫后１０ ｄ，动脉放血，分离 ＡＤ小鼠脑组织中的应用效果，报告如下。 血清，一８Ｏ℃保存。 １材料和赫 Ｌ ４ 静脉取血 …ｉｎ １．１ 多肽片段的挑选、合成 １０ ｍｉｎ离心分离血清检测抗体效价。以２ Ｉ．Ｌｇ／ｍＬ 根据Ｇｅｎｂａｎｋ中小鼠ＨＤＡＣ２的氨基酸序列 的多肽为抗原４℃过夜包被酶标板。第２天用ＰＢＳ （Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＢＣ０３１０５５），挑选３９２一 冲洗，分别加入免疫血清（一抗）和酶标羊抗兔ＩｇＧ ４１１ 位氨基酸位多肽为抗原（Ｎ ． （北京鼎国生物技术公司，货号ＥＩＡ－Ｏ０１１）。具体方 ＥＤＳＧＤＥＤＧＲＥＤＰＤＫ ＲＩＳＩＲＹ．Ｃ ）（图１）。多肽片段 法见文献［４］，显色后在Ｂｉｏ．Ｒａｄ ３３５０自动酶标仪 由北京中科亚光生物科技有限公司合成。纯 上读取４５０ ｎｍ光密度值。 ． 度９９％。 １．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ １．２ 多肽片段与钥孔戚血蓝蛋白（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ 按照文献［５］的方法从小鼠脑组织中提取 ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ，ＫＬＨ）的偶联ＨＤＡＣ２蛋白，将样品浓度调整至１．５ ｖ．ｇ／ｖ．Ｌ。与同 称取１２ ｍｇ多肽，用０．５ ｍＬ ｐＨ ７．４的ＰＢＳ溶 浓度的偶联多肽进行１０％ＳＤＳ．ＰＡＧＥ后转至硝酸 解，缓慢加入１０ ｍＬ ＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ，货号Ｈ８２８３）中，量 纤维素膜（ＮＣ膜）。把ＮＣ膜放人封闭液中，摇床上 取事先配好的联苯胺一亚硝酸盐混合物３５０ ｍＬ冰浴 温育ｌ ｈ。ＴＢＳ漂洗后，分别转移到１：１０００稀释的 冷却下缓慢滴加上述ＫＬＨ一多肽混合物中，冰浴反应 市售ＨＤＡＣ２抗体（ａｂｃａｍ公司，货号ａｂ５１８３２），室 １．５ ｈ时。置入透析袋，ＰＥＧ ６０００浓缩至２ ｍＬ。 温下振荡孵育２ ｈ，ＴＢＳ—Ｔ漂洗４次，每次１０ ｍｉｎ；加 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ．２００经水饱和后装柱，０．０５ ｍｏｌ／Ｌ磷酸 人１：１０ ０００ ＴＢＳ—Ｔ稀释的辣根过氧化物酶标记的 缓冲液（ｐＨ ７．２）平衡，缓慢上样，在２８０ ｎｍ监测下 羊抗鼠ＩｇＧ二抗溶液，室温下振荡孵育１ ｈ；ＴＢＳ—Ｔ 收集第一个峰。 漂洗４次，每次１０ ｍｉｎ；加入酶反应底物ＴＭＢ，反应 ｌ 疆燃 蹑嬲 露 鞠倡 ５３９溉 欧躁 晚圆 ６１毫曩赛烈阐 幽 融 蘸 嬉熙髓弱 ｌ亳ｊ 镊 联 喜ｊ５嗣 ｌ２１职赡 溅 熟器歉嘞 融 觏隐 １ ８１缀 臻 ～１‘＾＾＾＾＾ ＾ ＾ 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Ｍ，ｅｔ皇１．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ 且出现神经溃变和突触丢失等形态学变化并伴有 学习记忆能力下降等功能障碍。我们的多肽血清 可以特异识别Ａｐｐ／ＰＳ１双转基因小鼠脑内的 ＨＤＡＣ２，效价达到１：８００。可应用于神经退行性疾 ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ｂｙ ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ・１一ｐｈｏｓｐｈａｔｅ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２５：１２５４—１２５７ ［３］Ｊｅｎｕｗｅｉｎ Ｔ，Ａｌｌｉｓ ＣＤ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｎｅ ｃｏｄｅ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９３：１０７４—１０８０． 病、心脑血管疾病、肿瘤等ＨＤＡＣ２的体内、体外 研究。 ［４］颜子颖，王海林。译，Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎｅ ＲＥ。ｅｔ ａ１．（Ｅｄｓ）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｍｃ￣ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｍ］．精编分予 生物学实验指南．北京：科学出版社．１９９８：４１５． ［５］金冬雁，黎孟枫，译．Ｓａｍｂｒｅｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｍｉａｔｉｓ Ｔ． 要制备出理想的抗体，首先要有较纯的、抗原 性良好的免疫原；其次是选择一个合适的免疫途 径。小鼠的ＨＤＡＣ２序列含有４７８个氨基酸，其３９２－ ４１１位氨基酸位因亲水性较高，没有易发生折叠的 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ［Ｍ］．分子克隆实验指南．北京：科学出版 社．１９９５：８８８． ［６］ｊｉ Ｐ，Ｙｅｈ Ｖ，Ｒａｍｉｏｚ ｒＴ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ２ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｏｆ 半胱氨酸，末端不含影响免疫原性的芳香族氨基酸 等优势被本实验选为多肽抗原。化学合成的多肽 ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｏｕｓｃ ｆｅｔａｌ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌｓｔａｓ。Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃｎ［Ｊ］，２０１０， ９５：２０１３—２０２１． 作为抗原没有免疫原性，需要偶联到一个具有免疫 原性的载体蛋白上，将偶联物作为抗原免疫动物。 常用的载体蛋白有牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、卵蛋白 （ＯＶＡ）和钥孔戚血蓝蛋白（ＫＬＨ），其中钥孔戚血蓝 蛋白来自于软体动物，其序列与哺乳动物同源性很 小，而且该蛋白分子量较大，抗原性非常强，是目前 多肽抗体制备中应用最为广泛的载体蛋白。实验 结果显示，ＫＬＨ偶联的ＨＤＡＣ２多肽血清可与免疫 ［７］Ｇｕａｎ ｊｓ，Ｈａｇｇａｒｔｙ ＳＪ，Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ Ｅ，ｅｔ ａ１．ＨＤＡＣ２ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍｅｍｏｒｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｌｓｔｉａｃＳｔｙ（Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ， ２００９，４５９：５５—６０． ［８］Ｐｅｒｅｚ Ｍ，Ｓａｎｔａ－Ｍａｒｉａ Ｉ，Ｇｏｍｅｚ Ｄｅ Ｂａｒｒｅｄａ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｔａｕ一¨ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｄｅａｃｅｔｙｌｓｅ ＨＤＡＣ２ ｆａｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｅｈｅｍ。 ２００９，１０９：１７５６—１７６６． ［９］ Ｇｒｅｅｎ ＫＮ，Ｓｔｅｆｆａｎ ＪＳ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｃｏｒｉａ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｅｓｔｒｏｒｅｓ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｖｉａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｓｉｒｔｕｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ 原特异性反应，并与异常表达ＨＤＡＣ２组织发生反 应，说明多肽段的选择、偶联策略是正确的，可以应 用于抗血清的大量制备。 Ｔｈｒ２３１－ｐｈｏｓｐｈｏｔａｕ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｅｓｃｉ，２００８，２８：１１５００ —１１５１Ｏ． ［１０］Ｇｏｒｄｏｎ ＭＮ，Ｋｉｎｇ ＤＬ，Ｄｉａｍｏｎｄ ＤＭ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ａｎｄ ＡＢ ｄｅｐｏｓｉｍ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ＡＰＰ／ＰＳＩ ｍｉｃｅ 我们制备抗多肽血清未经过纯化，除多肽抗体 成分外还含有其它杂蛋自如血清中非抗体成分白 蛋白、免疫多肽无关的抗体成分等。这可能也是 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果中在４３—５５Ｋｄ间出现杂带的原 ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ，２００１，２２：３７７—３８６． ［修回日期）２０１３－０２－２６