乳铁蛋白

牛乳的成分牛乳组成成分••

牛乳组成复杂，是具有胶束特性的液体，也是含多种成分的混合物。它的主要成分为水，其次还含有糖类、脂类(以脂肪球形式存在于乳的液相中，主要成分为甘油三醋)、蛋白质、核酸、矿物元素及维生素等，如表

水分干物质糖类脂类-脂肪-磷脂-可溶脂类成分（g.kg-1）8741264738370.50.5•

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目前全世界婴幼儿配方食品中，用牛乳清蛋白（bovine whey proein）作为基料，使此类配方食品乳清蛋白与酪蛋白比例更接近人乳的比例，适应婴幼儿消化系统生理状态和生长发育需要。牛乳清蛋白除了作为营养素的功能外，还能促进骨骼健康，研究表明乳清蛋白浓缩物（WPC）和其中的乳碱性蛋白（milk basic protein,MBP）在体外和体内可显著地促进骨骼形成和抑制骨吸收。乳碱性蛋白（MBP）是来源于乳的有碱性的蛋白成分，其纯度约为97%。MBP的大部分是乳铁蛋白（lactoferrine, LF）和乳过氧化物酶

（lactoperoxidase,LPO）, 分别约占MBP的54%和41%；其他活性，碱性蛋白和其他乳蛋白约占MBP的2.4%。牛乳中含有LF20-200µg/ml。

因此，科学家更关注LF在促进骨骼形成和抑制骨吸收中的作用，发现乳铁蛋白能促进骨骼生长，在生理浓度下能有效刺激成骨细胞增殖和分化，抑制破骨细胞形成，在骨生长和代谢中起到一定的生理作用。也有人分析了LF 对骨骼肌的作用，能在一定程度上促进成肌细胞的增殖。

乳铁蛋白

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乳铁蛋白是（LACTOFERRIN, LF）是一种相对分子量约为80kDa的铁结合性糖蛋白。

主要存在于哺乳动物的乳汁当中，同时还存在于其他体液分泌液物中，如眼泪，唾液，气管及鼻腔分泌物，胰液和胆汁等外分泌液或血浆，中性粒细胞中。

乳汁，尤其是初乳中LF 含量很高，如牛初乳中的LF 质量浓度为1g/l 。人乳中含量2-4mg/ml, 牛乳中含量0.02-0.35mg/ml。

Groves 于1960年首次从牛乳中分离获得LF, 由于LF与铁结合形成红色的复合物，故也称其为，”红蛋白”。

LF 功能广泛，具有广谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁平衡，促进骨髓细胞生成，促进细胞生长，增强机体免疫，抗病能力，抑制人体肿瘤细胞作用，能与多种抗生素及抗真菌制剂协同作用，更有效治疗疾病。由此可见，乳铁蛋白可广泛应用于食品，生化，医药等领域。

乳铁蛋白的分布和结构

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目前,已明确清楚乳铁蛋白中多肽链的一级结构,牛乳中LF含量是703个氨基酸组成单一多链分子,其二级结构主要呈“二枚银杏叶型”,分别在分子的N-端和C-端形成2个环状结构(loops),每叶在内部隙处都有一个铁结合位点。

每一个铁原子(Fe3+)与乳铁蛋白上的4个残基相连:2个酪氨酸,1个天门冬氨酸,1个组氨酸.

每个分子中有2个金属结合位点，每个位点可结合一个Fe3+和一个HCO3-或CO3。Lf 的铁结合能力与盐的种类和浓度有关，在有较高浓度碳酸盐的场合，其铁结合能力增强，而在有较高浓度柠檬酸盐的情况下，其铁结合能力则减弱。

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乳铁蛋白作用机制

乳铁蛋白的生理功能

抑菌

避免刺激肠胃抗病毒

生理功能

抗氧化

调节免疫

双歧杆菌生长促铁吸收

1、抗-菌、病毒、寄生虫的作用及原理——夺铁1.铁离子是几乎所有细菌生长所必需的物质（是细菌生物氧化酶所必需的）。实验1.1、两个相同的培养基（甲、乙）加入15个大肠杆菌少量的Fe3+(1毫克)每次观察间隔时间为3个小时

2、在甲培养基中加入普通的蛋白质，乙培养基中加入乳铁蛋白(铁饱和度8%)3.每隔3小时后在加入2毫克Fe3+

•有研究表明当培养基中加入Fe3+时，随Fe3+浓度的加大抑菌作用减弱，当加入过量的Fe3+抑菌作用完全消失，这证明LF通过与细菌竞争铁离子达到抑菌的目的。

9080706050403020100甲乙369121、抗-菌、病毒、寄生虫的作用及原理——吸附和阻止•乳铁蛋白可粘附于细菌胞膜通过改变膜的通通性而使细菌死亡，可阻止病毒吸附于靶细胞上从而防止感染和阻止病毒复制。

2、防止肠胃炎的发生1、乳铁蛋白可保护消化道黏膜，避免被破坏，减少肠胃之感染并促进有益菌的生长，调理肠道菌群。➢

Teraguchi等人研究报告：

•用含有0.5%—2%乳铁蛋白的牛乳饲喂小白鼠，经过检测小白鼠消化道中的大肠杆菌繁殖受到抑制，也抑制了肠道细菌对脏器的侵入。同时，乳铁蛋白也促进双歧杆菌生长。•这个实验报告表明；乳铁蛋白减少肠胃之感染并促进有益菌的生长，调理肠道菌群。

3.乳铁蛋白的免疫

调节功能

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乳铁蛋白可促进其他免疫因子之产生，如IgM免疫球蛋白、T-淋巴球及B-淋巴球细胞，促进中性白细胞或巨噬细胞的杀菌作用和吞噬作用。

将100条金鱼预先用添加0.4％LF的饵料分别饲喂3天和14天，再和患白斑病的金鱼一起用普通饵料饲喂10天。（金鱼各100条）

8070605040302010010天喂LF3天喂LF14天普通饲料在口服LF对金鱼血液性状影响的试验中，发现淋巴球数随着饲喂天数的延长而增多4、促进铁离子的吸收1.乳铁蛋白可帮助铁质吸收，对于贫血有改善作用。

Kawakami实验：两只贫血相似小白鼠1号和2号，给1号食用结合铁的乳铁蛋白，2号食用硫酸亚铁，都达到同样的治疗目的：后者的入量是前者的4倍。单位;ug2001801601401201008060402001号2号结论；乳铁蛋白促进铁的吸收，减少铁的摄入量。降低铁的负作用。5、抑制脂肪过氧化作用•

•肠道内只要有微量的铁离子存在，它就可以作为脂质氧化和氧自由基产生的催化剂。

•实验证实：

•在pH值为7.4的NaCl溶液中，饱和度低于20%的乳铁蛋白，能够抑制牛脑磷脂脂质体的磷脂过氧化反应。

•如果乳铁蛋白的铁含量低，将更有效的阻止羟基自由基的生产(•OH )••

如果乳铁蛋白的铁饱和度低,将更有效的阻止羟基自由基的生产(•OH )

因此, 低铁含量、低铁饱和度和高含量的乳铁蛋白将更有效的阻止羟基自由基的生产(•OH )

乳铁蛋白能结合铁离子，可以抑制脂质氧化，阻断氧自由基的产生•LF的制备方法

•自1960年以来人们就试着采用各种方法来制备LF，如离子交换层析色谱, 超滤,固定化单克隆抗体, 亲和层析等从人乳或牛乳中分离纯化LF，但色谱法和固定化单克隆抗体法虽能获得较高纯度的LF但价格昂贵技术要求高, 所以并不适用于工业化生产.

•超滤法简便费用低,易形成工业化生产，但LF 纯度低膜需要经常清洗。

色谱法----吸附色谱法

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是利用固定基质和吸附质间物理或化学吸附强度的不同来分离物质的。疏水性的相互作用色谱在乳铁蛋白的分离上有重要的应用。一般以

Toyopearl为基质,在(NH4)2SO4溶液中达到吸附平衡后再装柱,用去离子水0.25mol/L HAc和0.25mol/L NaOH洗脱,得纯度为80%的乳铁蛋白,其缺点是吸附容量比较小,效率比较低.

离子吸附法

•1 最早利用DEAE纤维素阴离子交换树脂分离纯化得到较纯的Lf.

•2 磷酸纤维素交换色谱法

•羧甲基阳离子交换色谱法被广泛应用于Lf和乳过氧化氢酶的分离纯化

•用pH值7.7,浓度0.05mol/L的磷酸钠溶液或浓度0.3mol/LNaCl溶液作为洗脱液来洗脱,它可将Lf的a,b两种变异体分离出来,而且树脂能用浓度0.2mol/L的NaOH溶液和浓度0.2mol/L的HCI溶液再生,此法相对来说要更有效.

亲合色谱法

•不容基质-连接物-隔离臂-连接物-配体，基质一般用琼脂多糖,隔离臂一般多是有一定长度的可以连接基质的有机物•例如，肝素琼脂糖亲合色谱

能从琼脂乳中一步分离来得到乳铁蛋白,并且经电泳分析表明其纯度极高。

•例如，换Cu2+的1,4一丁二醇二环氧甘油醚

2+亚氨二乙酸琼脂糖,用Cu交换后该树脂呈

蓝色,装柱时上面1/2或2/3是铜树脂下半部分未直接交换的Cu2+树脂,洗脱液为用pH值8.0 浓度0.05mol/L的Tris-HAC溶液或浓度0.5mol/L的NaCI溶液作为洗脱液，一般来说,25mL的树脂可以吸附1L干酪乳清的Lf和免疫球蛋白,并且产品的纯度极高。

固定化单克隆抗体法

•利用抗原-抗体之间的高特异性结合

•在6～8周的鼠腹中注入人或牛的乳铁蛋白进行免疫,经一系列操作分离出抗体,用抗体和异丙醇活化的亲合凝胶混合制得免疫亲合色谱。

•用脱脂牛初乳或常乳作为料液, 用洗脱0.2 mol/L pH2.7醋酸缓冲液(含0.1 5mol/L NaCl)洗脱。但是成本贵。

超滤法

•是一种基本的膜分离技术，其原理是根据膜孔径不同可以实现不同分子质量和分子形状的大分子物质的分离，非常适合热敏性的功能性组分的分离。选用孔径或截留分子量不同的一系列超滤膜，可以以干酪乳清为原料生产Lf基料。

盐析法和层析法

•从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白并利用电泳和分光光度法检测其纯度和含量所获得的乳铁蛋白的分子质量为

90000Da,纯度大约为92%。采用3次盐析和1次凝胶层析的方法。

试验方法

•乳样前期处理：

•乳样在盐析和凝胶层析之前要进行前期处理,即除去脂肪和大量的酪蛋白；

•物料的前期处理方法基本相同采用新鲜牛初乳通过离心脱去脂肪(4℃，3000r/min、30min)得到脱脂乳，将脱脂乳稀释后，边搅拌边向其中加入1mol/L 盐酸溶液调整脱脂乳的pH 值到4.6(酪蛋白的等电点)，室温放置30min，离心除去酪蛋白(4℃、10000r/min、30min)，得到的上清就是我们需要的乳清，用它来分离Lf

•盐析：选用硫酸胺沉淀以除去分子量比较小的蛋白，将乳清用30%的饱和硫酸铵沉淀30min后，4℃条件4000r/min离40min;•将得到的上清液再用50%的饱和硫酸铵沉30min后,4℃条件下4000r/min离心40min，除去免疫球蛋白沉淀，将得到的上清液用•85%的饱和硫酸铵沉淀30min。

•此时需在PH8.5的情况下，4℃4000r/min,离心40min。

•此时收集沉淀，并用蒸馏水溶解。

•凝胶层析：

•为了获得较高纯度的LF，选用

•sephadex-G-100 对LF进行分离和纯化。•将透析后的乳清1mL加入平衡过的凝胶层析柱，在20℃条件下以0.2mL/min的流速进行洗脱，洗脱液选用pH7.4的PBs（Nacl含量8g/1000mL)，待出现峰值后收集洗脱液，每管收集lmL。

LF 的鉴定

•采用非连续性SDS-PAGE电泳对脱脂乳和盐析分离得到的上清液，以及凝胶层析的洗脱产物进行检测。

•采用分光光度法对凝胶层析所得到的乳铁蛋白的浓度进行测定。

结果与分析

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由于LF的pH为7.0-8.0,所以本试验凝胶层析选用的洗脱液为pH7.4的PBS，在这个pH范围内均可以得到LF。峰l

显示样品的吸收峰峰值较小，说明LF含量较低，但是非LF成分含量却很低,可以忽略,样品纯度比较高经SDS-PAGE检测仅出现一条可见的区带,相对分子质量为9000u,对电泳凝胶进行扫描和计算机分析LF的纯度达到92%,LF峰2和峰3显示样品的吸收峰峰值较大,说明LF含量较高,但是样品不纯,含有其他成分,经SDS-PAGE检测结果为峰2样品中含有两种成分,峰3样品中含有三种成分。峰IV则说明样品的各个成分含量都很低,经SDS-PAGE 电泳检测可见条带非常不清晰.分光光度法

采用分光光度法测定LF浓度,首先利用纯度为92%的LF溶液在400-650nm

下扫描，发现在475nm波长产生特征吸收峰(见图)于475nm测定其吸光度,作出浓度C与吸光度A之间关系的线性回归方程,得方程

2为:c=827.49A+5.7315(R=0.9954)。

图4显示A475值未能达到一般分光光度法的线性范围(0.1-0.7)。这是由于A475与LF铁饱和度有关100%铁饱和度的LF的A475仅为0.57。LF的铁饱和度越低,A475就越低。制备的LFA475为0.116,则质量浓度为101.73g/ml.

鉴于分光光度法快速，简便,对仪器设备的要求不高。

虽然准确性不是很高，但可以快速地测定LF的量适用于工厂中分离纯化过程中的在线检测。通过以上结果可见,采用3次盐析和1次凝胶层析提取LF的效果好于2 次盐析和2次凝胶层析，这试验所获得的LF的含量较高，能够减少再次凝胶层析过程中LF的损失，并且所获得的LF的纯度也较高，可应用于医药行业。

•非常感谢！