THE RNAi COMPANY
RNAi 产品使用手册
上海吉玛制药技术有限公司 Shanghai GenePharma Co.,Ltd.
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Ⅰ. RNAi 简介
A. RNAi 实验原理 B. RNAi 实验流程
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C. RNAi 实验所需试剂
D. 上海吉玛 RNAi 相关产品
Ⅱ. siRNA设计
A. 哺乳动物siRNA设计
B. 上海吉玛 siRNA 产品特性 C. siRNA oligo 技术数据
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Ⅲ. siRNA 对照
A. 普通阴性对照
B. 荧光标记的阴性对照 C. siRNA阳性对照 D. 转染试剂对照
E. 避免off-target对照
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Ⅳ. siRNA 转染
A. siRNA 转染的方法 B. RNAi-Mate 转染试剂
C. RNAi-Mate适用的细胞类型 D. 转染前细胞培养
E. RNAi-Mate：siRNA/DNA比例 F. 贴壁细胞转染程序
G. 悬浮细胞siRNA转染程序
H. DNA和siRNA共转染细胞程序 I. 体内siRNA导入方法
J. siRNA转染常见问题与建议
A. siRNA细胞转染条件优化 B. Real-Time PCR RNAi 效果检测
C. Real-Time PCR 结果分析
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Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测
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Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测
A. western-blot原理
B. western-blot操作步骤 C. western-blot上样液的制备 D. western-blot常用试剂的配制
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Ⅶ. RNAi实验常见问题解答
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Ⅰ. RNAi 简介
A. RNAi实验原理
RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
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B. RNAi实验流程
靶基因确认 (Target Gene Identification) siRNA设计 （siRNADesign）siRNA的制备 (siRNAGeneration)功能研究 （FunctionResearch）
RNAi结果检测 (Measure Knockdown)siRNA的转染 (siRNATransfection)C. RNAi实验所需试剂
试剂种类 siRNA oligo 试剂用途
与您所要敲除靶基因的转录本（mRNA）完全互补
转染试剂 如脂质体法，lipofectamin2000(invitrogen)，上海吉玛的转染
试剂RNAi-Mate，电穿孔法等
实验对照 包括阴性和阳性及Mocking control
基因表达的检测方如mRNA水平检测用qRT-PCR；蛋白表达水平检测用
western blot 法
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D. 上海吉玛 RNAi 相关产品
普通siRNA Oligo
化学修饰siRNA Oligo
荧光标记siRNA Oligo
siRNA oligo
siRNA阴性对照
siRNA 阳性对照
RNAi 转染试剂
siRNA 转染
RNAi表达 载体法
shRNA 表达载体
上海吉玛 siRNA Oligo 是在ISO9000质量标准下生产并经过了反复优化和严格测试；产品质量高度稳定，以退火双链RNA冻干粉的产品形式提交给用户。
上海吉玛 化学修饰siRNA Oligo 不仅增强了siRNA在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同时与标准siRNA作用时间相比，上海吉玛 化学修饰siRNA Oligo 的作用时间可延长一倍左右。
荧光标记siRNA oligo可用荧光显微镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等观察到，可直观地观察siRNA转染效率，优化转染条件；荧光标记的siRNA还可用于siRNA细胞定位及双标实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达结合起来。 上海吉玛 RNAi negative control与哺乳动物基因无同源性，作为实验的阴性对照，同时通过标记荧光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染的效率，有利于优化转染条件。荧光容易拍摄，它有很好的pH耐受性，因而在活细胞中更稳定。
上海吉玛 RNAi positive control用于确定实验中转染、RNA提取和检测方法的可靠性。上海吉玛提供的阳性对照包括LaminA/C、GFP22、Luciferase GL2、MAPK1、Beta-Actin、Vimentin、P53、GAPDH、Cyclophilin B等。
RNAi转染试剂是一种基于脂质的转染试剂，专门用于转染，确保没有RNAse活性，细胞毒性低。适用细胞广泛；可在含有抗生素的完全培养基中转染；即用型试剂，不必更换培养基，操作简便易行，重复性好，可在半小时内完成操作；介导siRNA高转染细胞和体内高效导入，即使在含血清培养基中也能表现高转染效率； 4℃下可长期保存。
上海吉玛 shRNA表达载体的特点是：克隆载体具有两种形式的克隆酶切位点BamH1和Bbs1，可形成非对称互补粘末端，保证插入片断的方向正确，有效避免载体自体连接；多种筛选标记确定稳定转染细胞系；GFP报告基因帮助评价转染效率并指示RNAi发生位点。上海吉玛现可提供8种 shRNA表达载体，详见公司总目录C-6页。
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核酸 抽提
基因 表达 检测
取；无论是小量的细胞（5×10）或组织（50-100mg）
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还是大量的细胞（10）或组织（>1g）都可得到出色的结果；操作简便，可实现RNA的快速抽提。Enzol 试剂是用于哺乳动物基因组DNA 抽提的试Enzol RNA Extraction
剂，适用于组织、单层或悬浮细胞的基因组DNAReagent
提取。通常使用本试剂，从20毫克组织可以抽提到约40微克基因组DNA，从106-107Hela细胞可以抽提到约25微克基因组DNA，是一种简单、快速、高效、经济的方法。
本试剂盒可以用来优化siRNA转染条件，也可作RNAi-Startup GAPDH
为RNAi实验的内参使用。荧光标记的dsRNA可Control Kit
直观地观察细胞转染情况；包含GAPDH siRNA阳性对照和阴性对照；应用Real-Time PCR方法准确评价转染前后GAPDH基因的RNAi抑制情况；为优化转染条件提供直观依据。
荧光标记的dsRNA可直观地观察细胞转染情况；RNAi-Startup GAPDH
包含GAPDH siRNA阳性对照和阴性对照；应用Basic Control Kit
Real-Time PCR评价转染前后GAPDH基因活性时,本试剂盒适用于Real-time PCR Core Reagent（目录号QSG-070）。
使用本试剂盒可以完成从“向细胞中导入siRNARNAi Gene-Knockdown
及转染效率评价”到“实时RT-PCR验证RNAi Easy Kit
Knockdown效果”的全部过程；荧光标记的dsRNA可直观的观察细胞转染情况；内含GAPDH siRNA阳性对照和阴性对照及 PCR扩增引物和探针，可应用定量PCR方法直观评价转染效率及验证GAPDH的RNAi抑制效果；可作为RNAi实验的阳性和阴性对照使用。
哺乳动物细胞中长链的双链RNA（dsRNA）能够RNAi-Startup IFN
Response Basic Control Kit 诱导干扰素效应，引起非特异性的转录抑制。如果
您不确定您的siRNA序列是否会诱发非特异性的IFN效应，则可用本试剂盒进行验证；应用Real-Time PCR检测非特异性IFN效应时，本试剂盒适用于Real-time PCR Core Reagent（目录号QSG-070）。
如果您不确定您的siRNA序列是否会诱发非特异RNAi-Startup IFN 性的IFN效应，则可用本试剂盒进行Realtime PCRResponse Control Kit
验证；同时检测PKR, OAS-1和 hStat1三个IFN效应基因并提供GAPDH管家基因对照；检测灵敏度高，结果直观且易于判断。
常备的RNAi管家基因Control 上海吉玛制备了一些常用管家基因的RNAi 实验
Control Kits，以方便广大科研工作者开展RNAi实试剂盒
验。详见上海吉玛产品目录荧光定量PCR分册C8页。
Ezol 试剂是用于总RNA 抽提的试剂，适用于人Ezol RNA Extraction
类、动物、植物、细菌等组织或细胞的总RNA提Reagent 6
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Ⅱ. siRNA 设计
A. 哺乳动物siRNA设计
基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因序列的选择。目的序列可以随机选择也可以通过在目的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。
哺乳动物
siRNA设计需要注意的几个方面
1． 从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，
并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA重复)来设计。
2． 避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。
3． siRNA序列的GC含量应为30%-60%左右。
4． 在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，
UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
5． 将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因
没有同源性。
6． 将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）
进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。
7． 选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列
的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
8． 阴性对照:一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的
siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样需要检查它和其他基因是否具有同源性。
9．有结果显示，UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别，因
为这个突出端无需和靶序列互补。合成siRNA时可直接提供以AA打头的21个碱基序列。
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B. 上海吉玛 siRNA产品特点
上海吉玛 拥有处于国际领先水平的siRNA化学合成的全部核心技术，包括RNA单体合成、普通siRNA合成、化学
修饰siRNA合成、荧光标记siRNA合成等。siRNA oligo 合成是在ISO9001质量标准及严格控制的流程和条件下完成的，确保了产品质量的高度稳定。化学合成siRNA有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。化学修饰的siRNA Oligo 不仅增强了siRNA在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同时也延长了siRNA的作用时间。
上海吉玛 siRNA产品特性
siRNA oligo 合成是严格控制的流程和条件下完成的；
质量控制 在ISO9000质量标准下生产；
产品经过分光光度计精确定量。
纯化 HPLC纯化；全长双链siRNA含量>97%
在3'和5'末端标记生物素、荧光素和磷酸等更加方便
标记和修饰
监测siRNA的抑制特异基因表达的效果
长度 19～23碱基/链
建议在-20°C的环境中存贮，避免多次冷冻和化冻处
储存和稳定性 理。上海吉玛保证在上述条件下寡核苷酸的稳定性可达
到6个月，荧光标记的RNA必须避光保存。
技术数据表与siRNA oligo一同交付， 包括名称、序
技术数据表
列、浓度、OD和nmols的精确数量、纯化类型。
个性服务 按照客户要求分装；免费设计服务。
C. siRNA oligo 技术数据
与siRNA相关的一些技术数据及注意事项
1． siRNA的平均分子量13,300。
2． siRNA oligo的OD、nmol和质量间有相应的公式可以计算；
一般情况下，对于一个21 bp的siRNA oligo，有如下简单关系：1 OD duplex＝3.0 nmols＝40 ug
3． 1 OD的siRNA欲溶解为20 uM的样品，可用150 uL DEPC
H2O去重悬1 OD的siRNA，溶解后为20 uM的样品。
4. 由于Oligo RNA呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散
失，所以打开管子前先离心，然后再慢慢打开管盖，溶解时请加足量DEPC水后盖上管盖，振荡溶解。
5．荧光标记的RNA，如FAM、HEX、TAMRA等标记的Oligo因为对光敏感，必须避光保存。
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Ⅲ. siRNA 对照
A．普通阴性对照
上海吉玛可提供与目的基因序列无同源性的通用阴性对照和将选中的siRNA序列打乱（scrambled）的普通阴性对照。
B．荧光标记阴性对照
上海吉玛可提供与目的基因序列无同源性的荧光标记（6-FAM）通用阴性对照。
C．siRNA阳性对照
阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。您可以利用阳性对照来确认RNAi
实验中转染、RNA提取和基因表达检测方
法是可靠的。
4 5 6 7 8 9 D．转染试剂对照
E．避免Off-target对照
1． siRNA实验应该有阴性对照；
2． 通用阴性对照为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对
照；
3． Scrambled阴性对照和选中的siRNA序列有相同的组成，但是
和mRNA没有明显的同源性；
4．阴性对照需要确定和目的靶细胞中其它基因没有同源性。
1． 上海吉玛 RNAi negative control与哺乳动物基因无同源性；
2． 通过标记荧光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染情况；
3． 可用于优化转染条件和评价转染效率；
4．具备很好的pH耐受性，在活细胞中更稳定。
上海吉玛可提供的siRNA阳性对照
1 LaminA/C 2 GFP22 3 Luciferase GL2 MAPK1 Beta-Actin Vimentin P53 GAPDH Cyclophilin B
对于一个完善的对照系统，转染试剂对照(Mock transfection )是不可缺的。转染试剂对照可以检测转染试剂对细胞的毒性、细胞的
成活率等细胞转染的各个因素影响。
对于RNAi研究来说，在哺乳动物中，off-target效应是一个十分关注的问题。有大量的报道，一个siRNA影响多个基因的表达。因此，大量研究关注于用针对同一个基因的不同区域的多个siRNA进行实验，然后分析各自对基因表达效果的影响。理想的结果是针对不同区域的siRNA对同一个靶基因产生相似的干扰效果。上海吉玛公司的技术人员为您针对同一个靶基因设计多对siRNA oligos,为您解决off-target的难题。
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Ⅳ. siRNA 转染
A．siRNA转染的方法
哺乳动物转染的常见方法有：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法（例如,显微注射和基因枪）、阳离子脂质体试剂，其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
应用脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几个方面：
1． 转染试剂的用量
2． siRNA的用量
3． 转染时的细胞密度
4． 转染时的操作顺序
5． 细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间
B．Lipofectamin2000 转染试剂
选择最适合的转染试剂和转染条件，往往 取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。Lipofectamin2000适用于核酸的体内和体外操作，可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染，也可应用于DNA/siRNA的共转染操作；是一种新型的高效siRNA转染试剂。
Lipofectamin2000的应用领域：
□ 原代培养细胞和转化细胞株的基因转染
□ siRNA高通量转染试验
□ DNA转染；DNA和siRNA的共转染
□ 核酸（siRNA、DNA、RNA）的体内导入试验
□ 贴壁细胞和悬浮细胞转染
Lipofectamin2000 的特点：
□ 不必更换培养基，操作简便易行，可在半小时内完成操作
□ 在含血清培养基中也能表现高转染效率
□ 细胞毒性低；适用细胞广泛
□ 即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染
□ 基于脂质的转染试剂，确保没有RNAse活性
□ 可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入
Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如：HeLa(人颈部癌细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。
C．Lipofectamin2000适用的细胞类型
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D．转染前细胞培养
在细胞板上培养细胞时，应使细胞汇合在24小时内达到70-90%。
细胞培养用品 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 35 mm 60 mm 表面积（mm/孔）
50 100 200 401 962 962 2827
2
细胞密度 培养基（μL /孔） 44
1.5×10-5.0×10 100μL 3.0×104-1.0×105 200μL 8.0×104-2.0×105 500μL
1.0 mL 1.6×105-4.0×105
2.0 mL 3.0×105-8.0×105
552.0 mL 3.0×10-8.0×10
666.0 mL 1.0×10-2.5×10
E．合适的lipofectamin2000用量
合适的siRNA(DNA)：lipofetamin2000比例对核酸的高效转染有重要影响；我们推荐的DNA：lipofetamin2000为1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：lipofectamin2000为1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情况下，此范围内都可获得高的转染效率。
siRNA/DNA Lipofectamin2000(siRNA/DNA) 细胞培养用品 培养基最终体积
96孔板 5pmol/0.2μg 100μL 0.25μl/0.5μl 24孔板 20pmol/0.8μg 500μL 1μl /2μl
1 mL 12孔板 40 pmol /1.6μg 2μl /4μl 2 mL 6孔板 100 pmol /4.0μg 5μl /10μl
35 mm 2 mL 100 pmol /4.0μg 5μl /10μl 60 mm 5 mL 600 pmol /8.0μg 10μl /20μl
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F．贴壁细胞转染程序
1． 转染前一天，4-5×104细胞接种在24孔板上， 0.5mL含FBS
和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培养基）细胞培养基。
选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很2． 选择用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合
达到70-90%。 重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。 3. 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无
血清培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混匀；
4. 混匀lipofectamin试剂，用50μl无血清的DMEM或
Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl lipofectamin试剂（DNA转染时，则加入2μllipofectamin试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟；
5. 将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合；轻柔混匀，室温
放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物。
6. 将100μl siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物
加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板板。
7． 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其
它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。
1． 转染的当天，收集细胞离心，用含FBS的培养基重悬。
2． 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无
血清的培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混匀；
3． 混匀lipofectamin试剂，用50μl无血清的DMEM或
Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl lipofectamin试剂（DNA转染时，则加入2μl lipofectamin试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟；
4． 将稀释好的siRNA和lipofectamin试剂混合；轻柔混匀，室温
放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物。
5． 再加入400μL细胞悬浮液（细胞数量决定于细胞类型和转染
后分析测试的时间）。
6． 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其
它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。
G．悬浮细胞转染程序
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H．DNA和siRNA共转染细胞
I．siRNA体内导入方法
1． 在转染的前一天，4-5×104细胞接种在24孔板上，0.5 mL含
FBS和抗生素的细胞培养基。
2． 选择用于初期接种的细胞密度，应能在24小时内使细胞汇合
达到70-90%。
3． 在100μL的无血清的培养基中稀释20pmol siRNA和0.2μg
DNA，加入2μl lipofectamin试剂，充分混合，放置20分钟,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin复合物。
4． 将siRNA/ DNA/lipofectamin复合物加入培养基中，轻轻混匀。
5． 细胞在37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它步骤。
1． 适量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的无菌水中，轻轻混
匀，因为注射液体积有限，建议采用高浓度的siRNA或DNA，一般DNA为2μg /μL、siRNA为10μg /μL。
2． 取适量的DNA、siRNA或siRNA\\DNA复合物与lipofectamin
混合。例如，在1#管中加入0.5μL的DNA（1μg）和0.5μL的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL的lipofectamin（24μg）和0.45μL不含RNA酶的无菌水中，将1#管中的溶液加入2#管中，在室温下温育30分钟，以形成siRNA/DNA-lipofectamin复合物。
3． 制备的siRNA/DNA-lipofectamine复合物可用于体内导入
siRNA、DNA或siRNA\\DNA。
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J．siRNA转染常见问题与建议
转染效率低
RNAi-Mate：siRNA(DNA)未优化
建 议
siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物浓度低
我们推荐的DNA：lipofetamin2000为1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：lipofectamin2000为1：0.01-1：0.1（pmol：ul） 可适当提高siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物的浓度
非最佳状态的细胞会降低转染效率，建议细胞接种后在24小时内达到70-90%，并在24小时内完成转染。
细胞生长状态不好
DNA或siRNA的纯度太低
使用高质量的DNA或siRNA，最好使用柱纯化的DNA和HPP级的siRNA
稀释DNA或siRNA的培养基中含有血清
一般情况下，血清不会明显降低siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物的形成，建议使用不含血清的培养基稀释DNA或siRNA
实验的重复性不好
细胞汇合情况不一致 细胞传代次数太多
建 议
使用相同数量的种细胞，接种后的培养时间、培养条件一致
使用传代次数较低的细胞
细胞出现明显死亡
与细胞生存相关的关键基因被关闭 细胞状态欠佳
重新设计实验
建 议
使用传代次数较低的细胞；细胞接种后在24小时内达到70-90%，并在24小时内完成转染。
siRNA/RNAi-Mate（或DNA/lipofectamin）复合物浓度过高
siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物一般不会影响细胞生长，当浓度过高时，有时也会产生毒性。
基因表达或基因沉默效果差
表达载体设计不对或siRNA设计不正确 转染后的培养时间过短
重新设计
建 议
基因需要一定时间表达，适当延长培养时间
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Ⅴ. mRNA 水平RNAi效果监测
A. siRNA细胞转染条件优化
证实siRNA的作用效果和优化转染条件的最佳方法就是：特异基因的siRNA处理的细胞与阴性对照siRNA处理的细胞，通过qRT-PCR监测靶基因转录水平。
1. 细胞转染条件优化实验流程（RNAi-Startup GAPDH Control Kit）
细胞培养 96孔板 24孔板 12孔板 6孔板 35 mm 60 mm
siRNA推培养基最终siRNA Lipofectamin
优化范围 推荐量 荐量 体积
5pmo 2.5-10pmol 100μL 0.25μl 20pmol 10-40pmol 500μL 1μl 40 pmol 20-80pmol 1 mL 2μl 100 pmol 100 pmol 600 pmol
50-200pmol 50-200pmol 0.3-1.2nmol
2 mL 2 mL 5 mL
5μl 5μl 10μl /
Lipofectamin
优化范围 0.1-0.5μL 0. 5-2μL 1-4μL 2.5-10μL 2.5-10μL 5-20μL
6-24小时后（取决于转染情况及细胞生长速率）荧光显微镜(λex = 494nm,λem = 519) 或流式细胞仪观察细胞转染情况 不同转染条件 GAPDH siRNA Positive control 转染 Mock transfection 24-72小时后 Scrambled siRNA NC-FAM转染 Ezol Total RNA Reagent抽提总RNA 取4ul（1 pg to 1 µg）qRT-PCR实验 确定最佳转染条件 1.2mockcondition1condition2condition3GAPDH/β-actin10.80.60.40.20
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本试剂盒可完成20次siRNA转染条件的优化，也可作为RNAi实验的内参使用。荧光标记的dsRNA可直观地观察细胞转染，评估转染效率并应用Real-Time PCR方法准确评价转染前后GAPDH基因的RNAi抑制情况。
2. RNAi-Startup GAPDH Control Kit 试剂盒组成
Amount500µl 1nmol 125µl 60µl 60µl 25µl 1ml
Component
Real-time PCR Master Mix（5×） GAPDH siRNA Positive control Scrambled siRNA NC-FAM
（20µM） GAPDH mix（10µM）
β-actin mix（10µM） Taq DNA polymerase （5U/µl） 1X RNA Dilution buffer
Storage 4℃ -20℃
*
-20℃ -20℃ -20℃ -20℃ 4℃
**
* 避光保存，避免反复冻融。
B. Real-Time PCR RNAi 效果检测
定量PCR是在传统PCR反应体系的基础上添加了具有荧光标记的探针，并通过检测PCR反应管内荧光信号的变化情况来实时监测PCR反应进行的情况。应用定量PCR检测RNAi效果只需要总RNA抽提及qRT-PCR两步。有关Real-Time PCR的原理请参阅上海吉玛 目录荧光定量PCR分册。
□EZOL试剂是用于总RNA 抽提的试剂，适用于人类、动物、植物、细菌等组织或细胞的总RNA提取。样本经 EZOL 充分裂解后加入氯仿离心，形成上清层、中间层和有机层， 收集上清层用异丙醇沉淀RNA。
20毫克组织或106-107个细胞/ml Ezol
混匀后室温搁置15min
按200ul氯仿/ml Ezol加入氯仿，振荡混匀，冰上放置10分钟
4℃ 12,000 rpm 15min
取上层水相移入0.5 ml EP 管内，加入等体积预冷的异丙醇
颠倒混匀，室温搁置10～15分钟
4℃ 12,000 rpm 10min，
轻倒上清，吸水纸上沾干，
按1ml乙醇/ml抽提液加入75％冰乙醇轻旋颠倒洗涤
4℃ 12,000 rpm 5min
轻倒上清，吸水纸上倒扣沾干，适度干燥
DEPC H2O或TE溶液溶解RNA
1. 细胞总RNA的抽提（Ezol Total RNA Extraction Reagent）
□产品特点
可获得高纯度、高产率的 RNA。
适用于多种细胞或组织总RNA的提取。
无论是小量的细胞（5×106）或组织（50-100mg）还是大量的细胞（107）或组织（>1g）都可得到出色的结果。
操作简便，可实现RNA的快速抽提。
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2．RT反应获得cDNA
RT反应混合物的配置过程应在冰上完成；各试剂使用前最好振荡混匀。
表. RT反应体系组成 Amount per reaction
Component
5μl 5×RT-Buffer
10mM dNTP 0.75μl
25mM Mg2+ 3μl
0.125μl Oligo dT15 （50μM） －μl（10～25ng） RNA 提取物
0.25μl RNAsin（40U/ul） 0.5μl M-MLV（200U/ul）
RNase Free H2O To 25μl总体积
* RT-PCR试剂盒（QPG-090）请见上海吉玛 产品目录荧光定量PCR分册F9页。
对于疑存在二级结构的RNA模板，可提高RT温度至42°C。
□ 37°C 孵育30分钟，进行RT反应； □ 85°C 10分钟灭活逆转录酶；
□ 如RT产物不及时使用，请于–20°C保存；
3. Real-Time PCR 反应
Per rxn
8μl
Component
使用TaqMan探针或SYBR Green1检测 时，荧光信号采集在PCR的延伸阶段；使用Beacon探针检测时，应在PCR退火阶段采集荧光。
5×PCR Master Mix（内含PCR引物，荧光探针等）
4μl RT 产物
0.4μl Taq DNA polymerase（5U/μl）
dd H2O To 40μl
* Custom Real-Time PCR Gene Detection Assay（QPG-010）请见上海吉玛 产品目录荧光定量PCR分册F4页。
Real-Time PCR 反应条件：
94_℃ for 2 min ，94_℃ for 20 s， 60℃30 s 40 cycles
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C. Real-Time PCR 结果分析
对于RNAi实验而言，我们通常需要知道的是某一特定细胞在导入siRNA前后某一特定基因的表达变化情况来判断siRNA起到了Gene Knockdown作用。应用荧光定量PCR的方法，可以通过两种途径来实现上述判断，一是测定特定细胞在导入siRNA前后某一特定基因mRNA数量的变化，即为绝对定量；二是通过检测特定基因与某一管家基因在在导入siRNA前后相对表达情况的变化，即为相对定量。通常采用相对定量的方法来检测siRNA的Gene Knockdown作用。
1．Real-Time PCR 实验设计
Real-Time PCR实验设计时应包括实验组（导入siRNA），阴性对照（Negative Control）和Mock Transfaction三组。每组至少三个重复。各组同时检测目标基因和管家基因的Ct值。下例中以GAPDH为管家基因。
实验组 NC Mock 1 2 3 1 2 3 GAPDH Average CT 1 2 3 GAPDH Average CT Gene1 Average CT GAPDH Average CT Gene1 Average CT Gene1 Average CT
2．Real-Time PCR得到siRNA导入前后目标基因和管家基因的Ct值
各组重复实验的Ct值差异不能
过大；一般地，重复实验Ct值差异在1以内是可以接受的。
Mock Transfection 实验组
Target Gene GAPDH Target Gene GAPDH Target Gene GAPDH
30.40 23.63 24.21 22.66 26.21 24.60
30.35 23.40 24.60 22.56 26.15 24.31
30.41 23.52 24.66 22.48 26.35 24.72
阴性对照（NC）
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3．Real-Time PCR数据分析
以Mock Tansfection为对照（Calibrator），管家基因为Normalizer，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组－( Ct目的基因- Ct管家基因)对照
ΔΔCt Target Gene ΔCt–ΔCt, Mock Rel. to Mock 0.00±0.21 1.0(1.16－0.86) 5.18±0.17 0.027(0.024－0.031)0.23±0.25 0.85(0.71－1.01)
Target Gene GAPDH ΔCt
Average Ct Average Ct Target Gene–GAPDH Mock 26.24±0.10 24.54±0.21 1.7±0.21
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实验组 30.39±0.09* 23.51±0.15*6.88±0.17*3 NC 24.49±0.24 22.56±0.09 1.93±0.25
*2 计算公式为
*3 计算公式为2
－△△Ct+S
，例如
和2
－△△Ct－S
注：*1 为同一样本重复实验的Ct值的标准偏差，可用Excel 计算得到；
＝0.17
，S为△△Ct的标准偏差，例如 2
－(－2.5+0.10)
＝5.3
1.2Relative Expression of TargetGene/GAPDH10.80.60.40.20Mock
实验组NC
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Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测
A. western-blot原理
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到硝酸纤维素薄膜上，然后利用抗体进行检测。
western显色的方法主要有：
1．放射自显影
2．底物化学发光ECL 3．底物荧光ECF 4．底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP即发光并使胶片曝光。
B. western-blot操作步骤
1．在使用之前将浸湿的Whatman 3M滤纸放于电极之间，放置10min。2．变性的细胞裂解液上样，20ug/道，80V, lhr; 100v, 4hr。 3．取下凝胶，用双蒸水洗后转入电转液，(39 mM glycin, 48 mM Tris-CI, 0.037 % SDS,20 % methanol)中浸泡。
4．剪6张与凝胶大小一致的Whatman 3M滤纸和1张硝酸纤维素膜，
在电转液中浸泡5 min。
5．用Bio-Rad半干式电转移装置，由下至上依次放置3层3M滤纸、
硝酸纤维素膜、凝胶、3层3M滤纸，赶走各层之间气泡，按0.65mA/cm2接通电流，转移2hr。
6．转移结束后，取出NC膜，用1xPonceau S染色2 min，稍漂洗后，标出Marker所在的位置，观察蛋白转移效果。
7. 将NC膜放入用1XTBST缓冲液(150 mM NaCI, 20 mM Tris-Cl
pH 7.6, 0.05Triton X-100)配制的0.5% dry milk中封闭2hr, RT。 8．加入抗一抗，室温杂交3 hr；1 X TBST洗膜3 X 10min。 9．加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温作用2hr。
10．1 X TBST洗膜3X10min。加入ECL化学荧光试剂A, B各0.5 ml
混匀，润透NC膜后室温作用1 min。
11．暗室中将膜迅速封入保鲜膜中X-ray film压片放射自显影5 min。12．置于显影液中I 5－30 sec，定影液中1.5 min，清水冲洗晾干。
C. western-blot上样液的制备:
1．细胞用生理盐水洗涤两次，每孔加入1OOuL双去污剂细胞裂解液，置4℃, 30min。
2．Eppendorf管置冰上，超声破碎细胞。 3．12000g,4℃离心1Omin。
4．上清入新管，取3u1细胞裂解液，稀释10倍，用BCA试剂盒测定细胞蛋白浓度。
5．加入2xLammilline溶液，100℃，5min，随后置于冰上冷却5min。6．放置-80℃待用。
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D. western-blot常用试剂的配制:
1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和
1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。
2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCl (pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCl混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C
保存。
4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释
到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合
反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制。
6、 SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚
蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘
氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、 转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量
1L。
9、 丽春红染液储存液：丽春红S 2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸 30g，加水至100ml。 用时上述储存液稀释10倍即
成丽春红S使用液，使用后应予以废弃。
10、 脱脂奶粉5%(w/v)。
11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、 过氧化物酶标记的第二抗体。
14、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
15、100mmol/L NaCl。
16、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
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Ⅶ. 常见问题解答（FAQ）
吉玛公司提供的siRNA是双链的还是单链的？
吉玛公司的siRNA是双链的,而且也是按照双链来定价的。
我们需要提供什么信息用于siRNA的合成？你们可以帮助免费设计吗？
您需要准确地提供siRNA的19个核苷酸的靶序列和悬垂的合成物，或者您也可以提供相应地基因的GeneID或者Accession Number，由我们公司技术人员为您免费设计。
如何选择siRNA的悬垂组成？
悬垂的序列组成是由顾客自行选择的。最近研究表明悬垂的组成在mRNA靶识别和酶解中不是很重要。悬垂可能在形成RISC的过程中起结构的作用。很多研究人员选择dTdT是因为研究表明脱氧核糖核苷能保护siRNA免受酶解。合成序列最重要的是确定靶mRNA的19个碱基的核心结构。
针对人体基因设计的siRNA对其他物种是否也有效？
一般siRNA都具有物种特异性，很少与其他物种有相同的靶位点，所以针对人体基因设计的siRNA不会沉默其他物种的同源序列。然而，也有研究表明siRNA经过特异性设计后能对两个或两个以上的物种有效，这需要仔细进行siRNA设计和生物信息学分析。
你们提供的siRNA是怎样装运的？如果在常温下放置了一个星期，还有效吗？
吉玛公司为您提供的siRNA是冻干粉包装的，在常温下运输。这些冻干的样品在室温下能稳定保存2－4个星期，所以放置一个星期不会影响其沉默效果。但我们建议您收到样品后最好保存于-20℃或-70℃有霜冷冻箱中。
在体外实验中，需要多少量的siRNA？
我们建议您用于实验的siRNA的浓度为100nM。1nmol siRNA的量对于一个24孔板或是96孔板的实验已经足够了。
用100nM 的siRNA转染时只得到50%沉默效率，我可以把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM吗？增加siRNA的浓度一般不能改进沉默效率。高浓度的siRNA将可能导致去靶作用和对细胞的毒性。siRNA的高基因沉默效率来自于合理的设计，在100nM 甚至更低的浓度都可能有75%的沉默效率。另外，低的转染效率会导致低的沉默效率，建议您更进一步优化siRNA的导入条件。
定量RNA的公式是什么？
研究者可以用Beer法则定量RNA：吸光度（260nm）=(摩尔消光系数)*(浓度)*(路径长度,cm)。为了便于理解，等式变为：浓度＝（吸光度,260nm）/[(摩尔消光系数)*(路径长度,cm)]。当使用一个标准的10mm比色皿时，在公式中路径长度这个变量等于1。
6uL浓度为10uM的siRNA溶解液中含有多少ug的siRNA？
首先计算含有多少nmol的siRNA： a. 等式: ? nmol = (6 uL)(10 umol/L)；b. 单位换算: ? nmol = (6 uL)(10 umol/L)(1 L/1,000,000 uL)(1,000 nmol/umol)；c. 答案: ? nmol = 0.06 nmol。然后利用siRNA的平均分子量（13,300 g/mol）把nmol变为ug：a. 等式: ? ug = (0.06 nmol)(13,300 g/mol)；b. 单位换算: ? ug = (0.06nmol)(13,300 g/mol)(1mol/1,000,000,000 nmol)(1,000,000ug/g)；c. 答案: ? ug = 0.798≈0.8 ug。所以6uL浓度为10uM的siRNA溶解液中含有0.8ug的siRNA。
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我需要浓度为20uM的样品，如何计算重悬siRNA缓冲液的量？
样品浓度的计算如下：（siRNA的量，nmol）/（重悬体积，uL）＝样品浓度，umol/L。在解答前应先统一单位，确保单位可以抵消。例如：您购买了20nmol的siRNA，想溶解为50uM的样品。可按以下方法计算重悬缓冲液体积：a. 等式: (20 nmol)/ ? uL = 50 umol/L；b. 解答未知量: ? uL = (20 nmol)(1 L/50 umol)；c. 单位换算: ? uL = (20 nmol)(1 L/50 umol)(1 umol/1,000 nmol)(1,000,000 uL/1 L)；d.答案: ? uL = 400 uL。因此，应该使用400uL缓冲液去重悬20nmol的siRNA，溶解后为50uM的样品。
一定需要阴性对照吗？
是，阴性对照是RNA干扰实验中不可缺少的。由于在超过200 nM的浓度下，siRNA有可能会导致非特异性的压力反应，在实验体系中必需设置阴性对照。它能够帮助我们确认基因表达水平的降低是否是序列特异性的RNAi的结果。由于siRNA的合成方法和工艺以及转染试剂等因素可能导致广泛的基因沉默现象。如果没有阴性对照，研究人员很可能错误地将广泛的、非特异性基因沉默当作由RNAi引起的基因特异性沉默。
常用的阴性对照有哪些类型?
常用的阴性对照大体分为两种，一种是使用通用阴性对照序列，该序列已经被上千篇文章使用；另一类是使用和靶基因siRNA打乱序列的siRNA作为阴性对照，这样的阴性对照和通用序列相比较，一方面合是按照定制产品价格合成的，另一方面，由于打乱序列是没有经过验证的序列，有可能会产生off－target现象。因此，除非有非常特殊的要求，最好使用通用序列作为阴性对照。
在阴性对照体系中和实验体系中观察到同样的实验结果，这是什么原因？
这个结果充分说明了设置阴性对照的必要性。该结果表明您所观察到的表型不是序列特异性knockdown产生的表型，您需要降低siRNA的工作浓度。
为什么说阳性对照在RNA干扰实验中很重要？
阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说，当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时，您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的。通常最好的阳性对照是内在的对照。
你们能提供预先合成的siRNA对照么？
用于对照的siRNA的最佳浓度是多少？
在siRNA 上进行标记的最佳位点在哪里？
反义链的5'端标记会影响siRNA的沉默活性，所以不推荐标记这个位点。在其他三个末端进行标记对沉默活性几乎没有影响。有研究表明正义链的5'端标记是最有效的化学合成位点。
荧光标记的siRNA是不是可以作为良好的对照？如何检测荧光标记的siRNA？
已经有为数不少的实验室研究过荧光标记的siRNA的荧光检测结果和knockdown效率之间的正相关关系。荧光标记双链是最常用的优化转染条件的方法。可以用流式细胞仪或者荧光共聚焦显微镜检测标记的siRNA。
荧光素的最大吸收率和发射率各在哪个波段？
荧光素在495nm处有最大吸收率，在520nm处有最大发射率。
阳性对照和阴性对照的siRNA的浓度都应该与基因特异性的siRNA的浓度相同。
可以。吉玛能提供许多预先合成的用于RNA干扰实验的对照双链。
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如何筛选转染试剂？
好的转染试剂有以下特点：1、对siRNA有较高的转染率；2、对细胞的毒性小。在mRNA水平检测siRNA导入的效果比用看家基因的siRNA阳性对照检测更为准确。
转染过程中发现大量细胞死亡，我应该如何处理？
如果出现细胞大量死亡，意味着您的转染条件仍然需要优化： 转染条件的优化一般包括以下几个方面： 1. 调整转染试剂的浓度；
2. 在转染后适当的时间内更换无转染试剂的培养液，
3.调整细胞的生长状态；一般处于良好生长状态的细胞对转染试剂就有更好的耐受性； 4.调整转染试剂和siRNA的比例；
如果同一管转染试剂在不同实验中对细胞的毒性有差异，一般说来应该是实验过程本身带来的差异； 如果已经做了以上几项工作，转染效率仍然得不到提高，建议您更换一种转染试剂。
如何将siRNA导入到细胞内？
使用什么样的转染方法，很大程度上取决于您使用的细胞系： 1.贴壁的、易转染的细胞，我们推荐使用RNAi-mate； 2.悬浮的或原代的细胞，我们推荐使用电击转化方法； 3.电击转化效率仍然很低的细胞，需要选择载体系统。
上海吉玛除提供化学合成的siRNA以外，还提供完整的载体系统，请参阅产品资料。
我的课题主要是研究细胞凋亡相关基因，我手上有一些新基因需要使用RNA干扰进行深入研究，我该如何选择对照系统？
用RNAi进行pathway研究，是RNAi主要应用之一。在这样的课题中，对照系统的选择尤其重要。已经发表的和已经验证的siRNA为RNA干扰研究提供了系统性对照。用RNAi进行细胞凋亡相关基因的研究，以往已经有众多的文献报道，可以查阅上海吉玛网站www.上海吉玛.com。
我刚刚开始接触RNA干扰技术，从文献上看，不同细胞应该选用不同的转染试剂，不同的研究目的，应该使用不同的siRNA，我的经费有限，如何有效确定我的研究体系？ 在开始RNA干扰研究之初，需要确定以下几个方面：
使用化学合成的siRNA还是使用载体构建shRNA？我们推荐您使用化学合成的方法来筛选有效的目的片段，然后把您筛选出来的目的片段插入到载体，进行抗性筛选，得到稳定表达的细胞株，再做长期研究。
反义核酸和RNAi有何差异？
反义核酸和RNAi从作用原理到使用的范围都有很大差异。这里只能做一个简单的介绍：从原理上说，反义核酸是一段与靶基因配对的单链DNA或类似DNA的片段与靶基因结合，结果阻止靶基因的转录或是翻译，以往的研究表明在反义核酸的研究中，序列的有效性和有效序列的非特异性往往有比较高的正相关性，这就在一定程度上限制了反义核酸的应用。
RNAi的作用机理是双链的RNA进入细胞内，导致靶基因的切割和降解。siRNA的序列可以选择在高度特异针对靶基因的位置，也就为RNAi作为药物研究提供了高效、低副作用的空间。自从RNAi技术问世以来，国外很多专业从事反义核酸研究的公司都纷纷转向RNAi研究， ISIS是一个非常就有代表性的例子。他们认为，如果使用反义核酸可以进行的研究，以及反义核酸可以涉及的研究领域，RNAi均可以毫不示弱的开展，并且应该会得到更加令人满意的结果。 我使用合成的双链DNA克隆载体，但是测序结果不正确，是DNA合成的问题，还是其他问题？
首先，质量良好的、并且是退火状态良好的dsDNA是克隆成功的关键因素。一般情况下，需要挑不止一个克隆测序（通
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常是2个以上），如果两个克隆的序列都是错误的，并且错误的碱基是相同的,那么基本可以确定是DNA oligo合成的问题. 如果两个克隆的不同碱基发生错误，有可能是合成片段本身的问题，也有可能是克隆过程造成的问题，可以再多挑1~2个克隆测序确证。大多数情况下，两个阳性克隆中，一般至少会有一个克隆是正确的，这种个别碱基在个别分子中的错误是合成和克隆过程共同造成的，但一般发生的几率较低。
我计划使用RT-PCR检测基因knockdown结果，之前应该注意哪些问题？
我们推荐RT-PCR的引物应该设计在target位置的两侧，而不是同侧。目前已经知道的siRNA介导的基因knockdown机制是RSIC先介导靶mRNA的切割，切割导致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的时间点，因此，设计于同侧的PCR引物可能导致假阴性结果或knockdown效率的低估。
另外，RT-PCR结果会因为靶基因mRNA降解时间不同、细胞内靶基因mRNA丰度不同而导致假阴性结果，特别对于丰度较高的基因，推荐使用的检测方式包括定量PCR、Northern检测、western检测等。这些方法会更加真实的反映RNAi的结果。
开始体内实验前需要注意什么问题？
体内实验设计包含动物模型的选择、给药途径、剂量和给药次数等等。siRNA使用的数量及浓度主要取决于给药靶点的性质，诸如肿瘤的类型，组织的类型，靶基因表达水平，动物模型个体大小等等，针对不同的研究模型，最好先查阅相关资料。
在体内研究中，最好的给药途径是什么？给药频率是多少？
寡核苷酸可以通过大剂量给药或使用ALZET微小泵持续给药。大剂量给药时要慎重，因为已有研究表明：一些毒性与寡核苷酸反义链的浓度有关，快速给药时可能会导致动物下肢瘫痪或致死，所以给药时要注意观察。很多已发表的论文实验是通过尾静脉给药的。任何给药方式都需要优化，以确保最佳的导入方式和动物的健康。一般拿静脉注射来说，每天注射一到两次，连续注射一到两周。
上海吉玛合成的siRNA是否可以用于动物水平的实验?
上海吉玛 的siRNA经过严格HPLC纯化,已经被用户通过局部注射用于小鼠的体内实验,并且得到满意的实验结果。
小鼠体内实验需要多少siRNA？
迄今为止还没有明确的siRNA体内实验使用量的计算方式，在实验前最好先从文献中查询是否已经有相关的文章发表。对于常规实验，一般使用100 µL的注射体积，浓度为10 to 500 µM。原先用antisense的研究表明，当剂量大于20 mg/kg/day (416 mM)时,会观察到明显的毒性。最好针对您的实验绘制剂量反应曲线。
常规情况下，给药剂量可以以 ~5mg/kg/day [~7.7 nmol/day or 100 mM per day]作为优化起点。需要注意的是，这个剂量只是一个预实验的起点，最后的给药剂量取决于动物模型、靶基因、靶组织和给药方式等因素。
沉默效果不理想，应该如何处理？
最常见的影响沉默效果的两个原因是：转染效率低和siRNA序列设计的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的细胞系，并发现沉默效果不佳，我们建议您对转染效率进行检测，并选择优化转染条件。如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依然存在，我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术，这也许能提高转染效率。如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到要求，可能是因为siRNA序列设计的效果不理想。
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