人副流感I型病毒大规模培养的方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108893451 A(43)申请公布日 2018.11.27

(21)申请号 201810818654.3(22)申请日 2018.07.24

(71)申请人 郑州伊美诺生物技术有限公司

地址 450016 河南省郑州市经济技术开发

区第六大街133号1号厂房(72)发明人 周伟伟　周雷鸣　孙静静　赵巧辉　

李桂林　付光宇　吴学炜　(74)专利代理机构 郑州异开专利事务所(普通

合伙) 41114

代理人 王霞(51)Int.Cl.

C12N 7/00(2006.01)

权利要求书1页 说明书2页

CN 108893451 A(54)发明名称

人副流感I型病毒大规模培养的方法(57)摘要

本发明公开了一种人副流感I型病毒大规模培养的方法，首先将人副流感I型病毒按0.001~0.01MOI接种于长满单层的Vero细胞上，然后于37℃、5%CO2培养；每天采用ELISA法检测上清中病毒效价，绘制病毒增殖曲线；至第7天，收取病毒培养上清，使用胰酶消化液消化细胞，按1:4-5进行带毒细胞的传代扩增，然后于37℃、5%CO2培养；重复收取病毒液，重新添加病毒培养液，或重复进行带毒细胞的传代扩增至所需规模。本发明在第7天进行带毒细胞的传代扩增，此时病毒效价高，细胞活率较好，减少了细胞制备量，缩短了培养时间，提高了工作效率；同时本发明按1:4-5进行带毒细胞的传代扩增，无需重新接毒，可根据需要扩大规模，满足了对人副流感I型病毒疫苗进行深入研究和制造的需求。

CN 108893451 A

权　利　要　求　书

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1.一种人副流感I型病毒大规模培养的方法，其特征在于：包括下述步骤：

第一步,将人副流感I型病毒按0.001~0.01MOI接种于长满单层的Vero细胞上，然后于37℃、5%CO2培养；

第二步，接种后，每天采用ELISA法检测上清中病毒效价，绘制病毒增殖曲线；第三步，培养至第7天，收取病毒培养上清，使用胰酶消化液消化细胞，按1:4-5进行带毒细胞的传代扩增，然后于37℃、5%CO2培养；

第四步，重复第二步收取病毒液，重新添加病毒培养液，或重复第三步进行带毒细胞的传代扩增至所需规模。

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人副流感I型病毒大规模培养的方法

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技术领域

[0001]本发明涉及病毒的培养方法，尤其是涉及一种人副流感I型病毒大规模培养的方法。

背景技术

[0002]人类副流感病毒(HPIVs)是引起儿童下呼吸道感染的一种病毒，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒 (RSV)。与RSV一样，人类副流感病毒可以造成反复发作的上呼吸道感染（如感冒和喉咙痛），同时它也能造成严重的反复感染的下呼吸道疾病（如肺炎，支气管炎和细支气管炎），特别是在老年人和有免疫缺陷人群中，其发病率更高。[0003]人类副流感I型病毒是单链的RNA病毒。病毒表面含有溶合酶和红血球凝聚素—神经氨酸苷酶的醣蛋白刺。从血清学上人类副流感病毒可分为I型、Ⅱ型、Ⅲ型、IV型，其中IV型又分a和b两个亚型。这些病毒颗粒大小不一（平均直径大小在150纳米～300纳米之间），形态各异。

[0004]目前为止，对于人类副流感I型病毒引起的呼吸道感染还没有特效药物，也没有制造出疫苗。而制造疫苗，就需要大规模培养人类副流感I型病毒。传统的培养方法是：细胞经逐级传代扩增，得到病毒接种后，经10~14天培养，然后再进行单批次收获。因人类副流感I型病毒病变不明显，产毒慢，培养周期长，成本高，严重影响了对人类副流感I型病毒疫苗的进一步研究。

发明内容

[0005]本发明的目的在于提供一种操作简单，能对人副流感I型病毒进行大规模培养的方法，以满足对人副流感I型病毒疫苗的研究和制造需求。[0006]为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的人副流感I型病毒大规模培养的方法包括下述步骤：

第一步,将人副流感I型病毒按0.001~0.01MOI接种于长满单层的Vero细胞上，然后于37℃、5%CO2培养；

第二步，接种后，每天采用ELISA法检测上清中病毒效价，绘制病毒增殖曲线；第三步，培养至第7天，收取病毒培养上清，使用胰酶消化液消化细胞，按1:4-5进行带毒细胞的传代扩增，然后于37℃、5%CO2培养；

第四步，重复第二步收取病毒液，重新添加病毒培养液，或重复第三步进行带毒细胞的传代扩增至所需规模。

[0007]本发明的优点在于在病毒培养第7天进行带毒细胞的传代扩增，此时病毒效价较高，细胞活率也较好，较传统单批次收获，减少了细胞制备量，缩短了培养时间，提高了工作效率；同时本发明按1:4-5进行带毒细胞的传代扩增，无需重新接毒，可根据需要扩大规模，满足了对人副流感I型病毒疫苗进行深入研究和制造的需求。

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具体实施方式

[0008]下面通过具体实例，对本发明方法作更加详细的说明,以便于本领域技术人员对本申请的理解。

[0009]本发明所述的人副流感I型病毒大规模培养的方法包括下述步骤：：

第一步,将人副流感I型病毒于37℃快速融化后，按0.01MOI计算病毒接种量，将所需体积的毒种接种于长满单层的Vero细胞上，并补加含有2%小牛血清的病毒维持液，于37℃、5%CO2培养；

第二步，接种后第1天，无菌抽取培养上清，使用ELISA夹心法检测上清中病毒效价，以后每天同步操作，绘制病毒增殖曲线。于第7天进行效价检测，酶免吸光值达到3.45，收取病毒培养液上清；若病毒维持液pH降低时，需要进行换液（病毒维持液），维持细胞活率；

第三步，收取病毒培养上清后，使用0.01mol/L的PBS冲洗细胞表面，弃去PBS后，加入胰酶消化液消化细胞，37℃放置5min，观察细胞呈细沙状散开，即为消化完成；加入含有2%小牛血清的病毒维持液，终止消化，然后按1:4~5进行第一次带毒细胞的传代扩增，然后于37℃、5%CO2培养；

第四步，当第三步扩增培养至第7天后收取病毒液，并使用ELISA夹心法检测上清中病毒效价，酶免吸光值达到3.57；使用0.01mol/L的PBS冲洗细胞表面，弃去PBS后,加入胰酶消化液消化细胞，37℃放置5min，观察细胞呈细沙状散开，即为消化完成；加入含有2%小牛血清的病毒维持液，终止消化，然后按1:4-5进行第二次带毒细胞的传代扩增，然后于37℃、5%CO2培养；

第五步，当第四步扩增培养至第7天收取病毒液，并使用ELISA夹心法检测上清中病毒效价，酶免吸光值达到3.78；显微镜观察细胞状态良好，无明显脱落、病变、死亡；使用0.01mol/L的PBS冲洗细胞表面，弃去PBS后,加入胰酶消化液消化细胞，37℃放置5min，观察细胞呈细沙状散开，即为消化完成；加入含有2%小牛血清的病毒维持液，终止消化，按1:4-5进行第三次带毒细胞的传代扩增，然后于37℃、5%CO2培养；

第六步，当第五步扩增培养至第7天收取病毒液，并使用ELISA夹心法检测上清中病毒效价，酶免吸光值达到3.67；显微镜观察细胞状态良好，无明显脱落、病变、死亡，说明带毒细胞还有传代能力。因计划需求，终止继续传代培养。

结论：使用带毒细胞传代3次，每次培养的第7天，培养上清中病毒液效价基本相当，说明人副流感I型病毒培养细胞带毒传代在细胞生长和维持活率的同时，病毒分泌量也能稳定，同时培养规模扩大了64倍。

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