维普资讯 http://www.cqvip.com 第３９巷第６期 东北农业大学学报 ３９ｆ６）：９８～１Ｏ１ ２００８年６月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｊｕｎｅ ２ｏ０８ 文章编号１００５—９３６９（２００８）０６—００９８～０４ 产肠毒素大肠杆菌Ｆ５菌毛基因的克隆与表达 于 迪 ，付海兵 ，丁 琳 ，师东方 ，单安山 （１．东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 １５００３０；２．东北农业大学动物科学技术学院、哈尔滨 １５００３０） 摘要：应用ＰＣＲ方法从产肠毒素性大肠杆菌（ＥＴＥＣ）中扩增出不舍信号肽序列的Ｆ５菌毛抗原基因片段，克 隆测序后将其连接到大肠杆菌表达栽体ｐＥＴ一３０ａ（＋）中，转化工程菌ＢＬ２１，经ＩＩｙｒ（ 诱导表达。经ＳＤＳ～ＰＡＧＥ和 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ分析，重组蛋白在ＢＬ２１中得到表达并与Ｆ５茵毛单因子血清发生明显反应 关键词：产肠毒素性大肠杆菌；Ｆ５菌毛；基因克隆；蛋白表达 中图分类号：￥８５２．６１ ２；Ｑｖｓ５ 文献标ｉＲｔｉ－￣：Ａ 产肠毒素性大肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉ— 抗Ｆ５菌毛单因子血清，购自中国兽药监察所；载 ｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ＥＴＥＣ）是猪的一种重要肠道病原菌，常见 体ｐＭＤ１８－Ｔ，购自宝生物（大连）工程有限公司； 的血清型有Ｏ 、Ｏ 、Ｏ Ｏ Ｏ。 、Ｏ。叭Ｏ。 等并 表达载体ｐＥＴ一３０ａ（＋）、ＴＧ１菌株及受体菌ＢＩ２１ 具有相应的菌毛＿】／。菌毛是ＥＴＥＣ的一个重要毒力因 由东北农业大学动物医学学院兽医微生物学与免疫 子 ，能与肠粘膜上皮细胞表面特异性受体位点相结 学实验室保存。 合，使细菌吸附于肠粘膜表面，产生肠毒素。导致 １．１．２酶及其他试剂 仔猪严重腹泻、脱水，最后衰竭死亡 。不同肠毒 限制性内切酶、ＤＮＡ聚合酶，购自宝生物 性大肠杆菌菌株的菌毛抗原类型不同，主要有Ｆ４ （大连）工程有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗 （Ｋ８８）、Ｆ５（Ｋ９９）、Ｆ６（９８７Ｐ）及Ｆ４ｌ、Ｆｌ７等类型， 兔ＩｇＧ、ＩＦＦＧ，购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＤＮＡ回收／纯 而在引起仔猪腹泻的肠毒性大肠杆菌（ＥＴＦＣ）中又以 化试剂盒，购自北京百泰克生物公司。 带有Ｆ４、Ｆ５菌毛抗原的细菌最为常见 １．２方法 肠毒素性大肠杆菌引起的仔猪腹泻给我同养 １．２．１ ＰＣＲ扩增 猪业带来了严重的经济损失。 内多用带有不同 参考ＧｅｎＢａｎｋ｝二的Ｆ５菌毛编码序列（登录号： 类型菌毛的ＥＴＥＣ制备灭活疫苗或构建携带不同菌 Ｍ３５２８２），利用Ｐｒｉｍｅｒ ５．０软件设计１对ＰＣＲ引物 毛抗原基因的重组质粒，制备基因Ｔ程疫苗进行 Ｐ１、Ｐ２，以Ｃ８３５２９菌株中提取的质粒为模板，扩 免疫预防ｌ６＿ 。因此，表达纯化不同菌毛蛋白作为 增出不含信号肽序列的Ｆ５菌毛基因片段。 抗原检测疫苗免疫抗体水平和制备单克隆抗体检 Ｐｌ：５ （三ＧＡＴＣ ＣＧＡＡＴＡＣＡＧＧＴＡＣＴ３ （Ｎｃｏ Ｉ： 测特异性抗原将发挥重要作用。 Ｃ鱼 ～Ｇ）； １ 材料与方法 Ｐ２： ５ ＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＴＡＣＡＴＡＴＡＡＧＴＧＡＣ３ （Ｘｈｏ Ｉ： ＧＡＧ）。 １．１材料 ＰＣＲ及应参数为：９５ ５ ｒａｉｎ，９４ ｏＣ １ ｍｉｎ， １．１．１ 菌株、血清和质粒 ５０．８ ｏＣ １ ｍｉｎ，７２℃４５ ｓ，３０个循环，７２℃１０ ｍｉｎ。 产肠毒素性大肠杆菌Ｃ８３５２９（Ｏ㈨：Ｋ９９）、兔 反应体系为（２５ ＩｘＬ体系）：模板ＤＮＡ １ ＩｘＬ， 上下游弓Ｉ物各ｌ Ｉ ， ＤＮＡ聚合酶０．５ ＩｘＬ， 收稿日期：２００７—１２－２７ 基金项目：尔北农业火学饺长基金、 尼汀省“｛‘五”重点攻关项 ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２．５ ＩｘＬ，ｄＮＴＰ ２ ＩｘＬ，去离子水１７ Ｌ。 目（ＧＢＯ５Ｂ５０１）；黑坨江古博上后资助经费 １．２．２重组质粒的构建与筛选 作者简介：于迪（１９８２一），男，黑尼江人，硕上研究生 研究方 向为畜禽传染痫诊断试剂 究 含Ｆ５菌毛基因的重组质粒的构建和筛选方法 通讯作者Ｅ １ａｉｌ：ｓｈｉｄｆ＠ｎｅａｕ ｅｄｕ．‘、ｎ 见文献【８】 经酶切和ＰＣＲ 法初步鉴定后的阳性 维普资讯 http://www.cqvip.com 第６期 于迪等：产肠毒素大肠杆菌Ｆ５菌毛基因的克隆与表达 重组质粒命名为ｐＭＤ—Ｆ５。重组质粒ＤＮＡ序列由 北京华大基因研究中心测定。所得序列用 ＤＮＡＭＥＮ软件进行分析，并与ＧｅｎＢａｎｋ中已发表 的Ｆ５菌毛序列进行分析、比较。 １．２．３表达载体的构建与筛选 将ｐＭＤ—Ｆ５和ｐＥＴ一３０ａ（＋）用Ｘｈｏ Ｉ和Ｎｃｏ １ 分别双酶切，产物连接后转化ＢＬ２１基因工程菌， 涂布于ＬＢ固体培养基（Ｋａｎ ３０ Ｉｘｇ・ｍＬ ）上，３７℃ 培养过夜，挑取白色菌落接种于液体ＬＢ培养基 （Ｋａｎ ３０ Ｉｘｇ・ｍＬ ）中，３７℃振荡培养１２ ｈ，提取质 粒经ＰＣＲ和酶切鉴定后，所得阳性菌株命名为 ＢＬ２１（＋Ｆ５）。 １．２．４重组蛋白的表达与检测 重组菌ＢＬ２１（＋Ｆ５），经ＩＰＴＧ（终浓度１ ｍｍｏ｜・Ｌ－Ｉ） 诱导４ ｈ处理后，取１ｍＬ菌液离￣（１２０００ｒ・ｍｉｎ４，４℃） １ ｍｉｎ，弃上清，ｄＨ Ｏ洗涤１次，用ＰＢＳ（ｐＨ ７．４） 悬浮细菌沉淀，加入等体积的蛋白上样缓冲液，沸 水浴１０ ｍｉｎ，离心１０ ｍｉｎ后，取上清１０ Ｌ进行 ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ．检测ｌ９１，以Ｆ５菌毛 单因子血清作为第一抗体，按１：１００稀释使用；辣 根过氧化物酶标记的羊抗兔ＩｇＧ抗体作为第二抗 体，按１：１ ０００稀释使用。将诱导后重组菌体经超 声波破碎，裂解液裂解，离心，收集上清和沉淀， 提取包涵体ｌ８１，进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析。 ２ 结果与分析 ２．１ Ｆ５基因的克隆及其重组质粒的鉴定 以Ｃ８３５２９菌株的质粒ＤＮＡ为模板，Ｐ１、Ｐ２ 为上下游引物的ＰＣＲ扩增产物经琼脂糖凝胶电泳 分析，结果显示，产物大小与预期相符（４９６ ｂｐ） （见图１）。重组质粒（ｐＭＤ—Ｆ５）经Ｘｈｏ Ｉ、Ｎｃｏ Ｉ双 酶切，Ｘｈｏ Ｉ单酶切和ＰＣＲ扩增的目的带大小与预 期相符（见图２）。ＤＮＡ测序显示，扩增的Ｆ５菌毛 蛋白基因不含信号肽，与参考序列比较，第６５位 碱基为Ｇ而不是Ｃ，其它碱基序列均与文献［１０］报 道的Ｆ５菌毛蛋白基因相同，其同源性为９９．８０％。 ２．２重组表达质粒的构建与鉴定 将 基因片段插入ｐＥＴ一３０ａ（＋）构建的重组表 达质粒ｐＥＴ—Ｆ５经Ｘｈｏ Ｉ、Ｎｃｏ Ｉ双酶切得到两条 目的带（５ ３６８，４８８ ｂｐ），Ｋｐｎ Ｉ单酶切得到１条目的 带（５ ８５６ｂｐ），ＰＣＲ扩增出１条目的带（４９６ ｂｐ），结 果与预期相符，表明 基因片段正确插入表达载 体（见图３－ａ、ｂ）。 ２０００ ｂｐ １０００ ｂｐ ７５０ ｂｐ ５００ ｂｐ ２５０ｂｐ １００ ｂｐ １－ＰＣＲ负对照；２－含Ｆ５基因的ＰＣＲ产物（４９６ ｂｐ）； ３－ＤＬ２０００ ＤＮＡ分子量标准 １－Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；２－Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＰＣＲ（４９６ ｂｐ）； ３－ＤＬ２０００ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍａｒｋｅｒ 图１ Ｆ５基因片段的ＰＣＲ产物 Ｆｉｇ．１ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ Ｆ５ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ２０００ ｂｐ １０００ ｂｐ ５００ ｂｐ １－ＰＣＲ负对照；２一含Ｆ５基因的ＰＣＲ产物（４９６ ｂｐ）； ３－ＸｈｏＩ单酶切产物（３ １８８ ｂｐ）；４一ｘ Ｉ、ＮｃｏＩ双酶切产物（２ ７００， ４８８ ｂｐ）；５－ＤＬ２０００ ＤＮＡ分子量标准 １一Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；２一Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＰＣＲ（４９６ ｂｐ）； ３－Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭＤ—Ｆ５ ｗｉｔｈ Ｘｈｏ Ｉ（３ １ ８８ ｂｐ）： ４一Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ—Ｆ５ ｗｉｔｈ Ｘｈｏ Ｉ ａｎｄ Ｎｃｏ Ｉ ｆ２ ７００，４８８ ｂｐ）；５一ＤＬ２０００ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍａｒｋｅｒ 图２重组质粒ｐＭＤ－Ｆ５的鉴定 Ｆｉｇ．２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭＤ－Ｆ５ １ ２ ３ ２０００ ｂｐ—＋ １０００ ｂｐ—＋ ５００ ｂｐ—＋ ９６ ｂｐ 维普资讯 http://www.cqvip.com 尔北农业大学学报 第３９卷 ●１０００ ｂｐ ● ５００ ｂｐ ｂ ａｌ—ＤＬ２０００ ＤＮＡ分子量标准；ａ２一ＰＣＲ产物（４９６ ｂｐ）；ａ３一ＰＣＲ负对照 ｂｌ—Ｘｈｏ Ｉ、Ｎｃｏ Ｉ双酶切产物（５ ３６８，４８８ ｂｐ）； ｂ２一 ｎ Ｉ单酶切产物（５ ８５６ ｂｐ）；ｂ３一ＤＩ２０００ ＤＮＡ分子量标准； ｂ４一ＤＩ １５０００ ＤＮＡ分子量标准 ａ １一ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；ａ２一Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＰＣＲ（４９６ ｂｐ）； ａ３一Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；ｂｌ—Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥｑ、－Ｆ５ ｗｉｔｈ Ｘｈｏ Ｉ ａｎｄ Ｎｃｏ Ｉ（５ ３６８．４８８ ｂｐ １： ｂ２一Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ—Ｆ５ ｗｉｔｈ Ｋｐｎ Ｉ（５ ８５６ ｈｐ）； ｂ３一ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；ｂ４一Ｄ１ １５０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ 图３重组质粒ｐＥＴ—Ｆ５的鉴定 Ｆｉｇ．３ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ－Ｆ５ ２．３ Ｆ５重组菌毛蛋白基因的表达 对诱导后重组菌和提取的包涵体，进行ＳＤＳ— ＰＡＧＥ分析结果见图４，可以看出Ｆ５重组蛋白基 因大约在２３ ｋｕ处出现明显地高水平表达，经薄层 扫描分析，该重组蛋白约占菌体总蛋白的３０％， 分子量大小与理论值一致ｌ】 Ｉ；并且证明其重组蛋白 存在于包涵体中。 卜ｌ１６ ｋｕ ・■ ６６ ｋｕ ●４５ ｋｕ 卜３５ ｋｕ ●一２５ ｋｕ １一末诱导的ＢＬ２１（＋Ｆ５１；２－１ＰＴＧ诱导后的ＢＬ２１（＋Ｆ５）裂解的溶液Ｉ 清； ３、４－ＩＰＴＧ诱导后的Ｂ１ ２１（＋Ｅ５１；５－１ＶＩ＇Ｇ诱导的ｐＥＴ３０ａ（＋）￣载体； ６－８—１ＰＴＧ诱导后的ＢＬ２１（＋Ｆ５）裂解的溶液沉淀；９－标准蛋白Ｍａｒｋｅｒ １－Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＢＬ２ １（＋Ｆ５１ ｗｉｔｈ ｎＯｌｌ—ｉｎｄｕｃｅｄ（：ｅｌｌ： ２－Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｌｙｓａｔｅ ｏｆ ＢＬ２１（＋Ｆ５）ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ＩＩＹＦＧ：３，４一Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＢＬ２ １（＋Ｆ５１ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ １ＰＴＧ；５－Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｐＥＴ３０ａ（＋１ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ １ＰＴＧ：６－８一Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＬ２Ｉ（＋Ｆ５１ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ １ＰＴＧ；９－Ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ 图４ Ｆ５重组蛋白的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳分析 Ｆｉｇ．４ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｆ５ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ２．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测 以免抗Ｆ５菌毛因子抗血清作第一抗体，辣根过 氧化物酶标记的羊抗兔ＩｇＧ抗体作第二抗体进行的 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ分析结果见陶５，可看出表达的重组蛋 白与兔抗Ｆ５菌毛单因子血清能发生特异性反应。 １一｝，示准低分子量蛋Ｆ＝１ Ｍａｒｋｅｒ；２－ＢＬ２１（＋Ｆ５）表达产物； ３一ｐＥＴ一３Ｏａ㈩表达产物 １一ＬＭＷ Ｍａｒｋｅｒ；２－Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＢＬ２ｌ（＋Ｆ５１： ３－Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｎｃｔ ｏｆ ｐＥＴ一３Ｏａｆ＋１ 图５ Ｆ５重组菌毛蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测 Ｆｉｇ．５ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ Ｆ５ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ ● ＾ ５ 诃、Ｉ １，、＾仑 近年来，国内外对ＥＴＥＣ的分子结构、致病机 理及免疫防治等方面进行了大量的研究。研究证 明，非侵袭性细菌进肠道后，借助位于细菌表面的 菌毛粘附在宿主小肠上皮细胞表面，繁殖并分泌毒 素。毒素进入小肠上皮细胞导致水钠代谢混乱，引 起分泌性腹泻［１２－１３Ｉ。ＥＴＥＣ菌体表面的菌毛具有抗 原活性，注射含有菌毛抗原的疫苗可以保护幼畜免 受ＥＴＥＣ的感染，而Ｆ５菌毛是该类致病菌所携带 的主要菌毛抗原之一ｌＩ ４＿。 国内针对ＥＴＥＣ菌毛疫苗有许多研究…ｓ ，现 有的Ｋ８８、Ｋ９９双价基因丁程疫苗在预防仔猪腹泻 方面发挥着积极的作用。目前，生产上尚缺少简 便、快速、灵敏的方法来检测免疫母猪血清或初乳 中抗体效价。用重组蛋白作检测抗原可建立特异、 敏感的检测方法，克服用全菌或提取菌毛制备检测 抗原的一些缺点。本研究表达的重组Ｆ５抗原蛋 白，经免疫印记试验证明具有良好的抗原性，可作 为含Ｆ５的基因工程疫苗免疫抗体的检测抗原。同 时，为进一步研制单克隆抗体，建立Ｆ５菌毛快速 检测方法奠定了物质。 维普资讯 http://www.cqvip.com ［ 【 【 ［ ［ 【 ［ ［ ［ｒ【 第６期 Ｊ ¨ 】 于】 纠 迪等：产肠毒素大肠杆菌Ｆ５菌毛基因的克隆与表达 ｊ 】 】 Ｊ Ｊ 引 ● ｌ ・ｌ０ｌ・ ｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］．ＦＥＭ Ｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８４，２２：２５３—２５８． ［参考文献］ ［１１］Ｄｅ Ｇｒａａｆ Ｆ Ｋ，Ｋｌｅｍｍ Ｇａａｓｔｒａ Ｗ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．ａｄｈｅｎｓｉｖｅ ａｎｔｉ— 崔德凤，张永红．肠毒素型大肠杆菌菌毛的研究进展ｆＪ】．北京农 ｇｅｎ Ｆ５ ｌＪＪ．Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ，１９８１，３３：８７７—８８３． 学院学报，２００１，ｌ６（３）：９３—９６． ［１２］Ｒａｏ Ｍ Ｃ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｔｅｍｔｏｘｉｎｓ［Ｃ］／／Ｆａｒ— 陈小云．产肠毒素性大肠杆菌的致病因子研究概况【ＪＪ．预防兽 ｔｈｉｎｇ Ｍ Ｊ Ｇ Ｋｅｕｓｃｈ Ｇ Ｅｎｔｅｒｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ 医学进展，２０００，２（３）：１９—２１． ａｎｄ ｍａｎａｇａｍｅｎＬ Ｌｏｎｄｏ￣Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａ｝ｌ，１９８９：８７－１０４． 李春华，梁宏德．Ｋ８８、Ｋ９９基因工程菌菌毛抗原的提纯及其检 ［１３］Ｅｌｓｉｎｇｈｏｒｓｔ Ｅ Ａ，Ｗｅｉｔｚ Ｊ Ａ．Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ 测【ＪＪ．河南畜牧兽医，１ ９９９，２０（４）：７． ． ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｅ Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｉｂ ｌｏｃｕｓ ｉｓ ａｓｓｏ— 申慧峰，王玉炯，黄亚红．Ｋ８８ ａｄ ＥＴＥＣ菌毛蛋白亚基基因如ｅｃ ｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ １０４－ｋｉｌｏｄａｈｏｎ ｏｕｔｅｒｍ ｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ【ＪＪ．Ｉｎｆｅｃｔ 的克隆表达及多克隆抗体的制备ｆＪＪ．上海农业学报，２００５，２１ Ｉｍｍｕｎ，１９９４，６２：３４—６３． （２）：５一ｌ０． ［１４］Ｉｓａａｃｓｏｎ Ｒ Ｅ，Ｄｅａｎ Ｅ Ａ，Ｍｏｒｇａｎ Ｒ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｏｆ ｓｕｃｋ 房海．大肠杆菌新菌毛抗原的研究ｆＪ】．畜牧兽医学报，１９９４，２５ ｌｉｎｇ ｐｉｇｓ ａｇａｉｎｓｔ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｒｒ— ｆ４）：３４６—３５２． ｈｅａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｖａｃｃｉｎａｔｉｎｇ ｄａｍｓ ｗｉｔｈ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｆ５ ａｎｄ ９８７ｐ ｐｉｌｌ： 张景六，蔡瑞珠，洪盂民．带有Ｋ８８与Ｋ９９两种菌毛抗原基因 ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｆｎｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， 的重组质粒的构建【Ｊ｝＿生物工程学报，１９８５，ｌ（２）：３４—４０． １９８０，２９：８２４—８２６． 黄培堂，李丰生，王叙甫，等．表达Ｋ９９和Ｆ４１双价保护性抗原 ［１５］张景六，蔡瑞珠，洪盂发．带有Ｋ８８与Ｋ９９两种伞毛抗原基因 工程菌株的构建及免疫效果研究【ＪＪ．中国科学Ｂ辑，１９９３，２３ 的重组质粒的构建【Ｊ】．生物工程学报，１９８５，ｌ（２）： ３４＿４０． ｆ９）：９６０－９６５． ［１６】孙玉昆，顾大年，巫爱珍．幼畜腹泻双价基因工程疫苗（Ｋ８８、 萨姆布鲁克 弗里奇Ｅ Ｆ，曼尼阿蒂斯Ｔ．分子克隆实验指南 Ｋ９９）的高密度发酵生产工艺及抗原过量表达【ＪＪ．生物工程学 ［Ｍ］．２版．金冬燕，黎孟枫，侯云德，等译．北京：北京科学出版 报，１９９０，６（２）：９６—１０１． 社．１９９２：２５—６３． ［１７］陈章水，郭三堆．表达Ｋ８８、Ｋ９９双纤毛抗原及Ｋ９９纤毛抗原 卢圣栋，现代分子生物学实验技术［Ｍ］．２版．北京：中国协和医 的产肠毒素大肠杆菌的构建【ＪＪ．中国畜禽传染病，１９９２，５：３７— 科大学出版社，１９９９：３８０—３８２． ４１． Ｒｏｏｓｅｎｄａａｌ Ｂ，Ｇａａｓｔｒａ Ｗ，Ｄｅ Ｇｒａａｆ Ｆ Ｋ．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ［１８］刘兴汉，王莉林，初晓白，等 Ｋ８８、Ｋ９９、Ｆ４１三价基因工程菌 ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｆ５ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｄ— 的构建［ＪＪ＇中国畜禽传染病，１９９１，６：４６—４９ Ｃｌｏｎｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｉｌｉ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｆ５ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｔｅｒ０ｔ０ｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ） ＹＵ Ｄｉ ，ＦＵ Ｈａｉｂｉｎｇ ，ＤＩＮＧ Ｌｉｎ ，ＳＨＩ Ｄｏｎｇｆａｎｇ ，ＳＨＡＮ Ａｎｓｈａｎ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５００３０，Ｃｈｉｎａ； ２ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５００３０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ Ｆ５ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｆｒｏｍ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ ｃｏｌｉ．Ａｆｔｅｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ａｎ Ｅ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ＤＥ ３０ａ（＋），ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ ｃｏｌｉ ＢＬ２１，ａｎｄ Ｅ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ｆ＋Ｆ５１ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｃｕｈｕｒｅｄ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ Ｉ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂ１０ｔ．Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｕｌｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ Ｆ５ ｐｉｌｉ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｄｒ０ｔｅｉｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＥＴＥＣ；Ｆ５ ｆｉｍｂｒｉａｌ；ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ；ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
