２００第４卷９年９月 第９期 中国科技论文在线Ｓｃｉｅｎｃｅｐａｐｅｒ Ｏｎｌｉｎｅ Ｖｏｌ ４Ｎｏ．９ Ｓｅｐ．２００９ 多色荧光稀土纳米颗粒的制备与应用 蒋鸿飞，叶志强，刘潇或，王桂兰，袁景利 （大连理工大学精细化工国家重点实验室，辽宁大连１１６０１２） 摘要：由于稀土荧光化合物中只有Ｅｕ（ＩＩＩ）与１１）（１ＩＩ）的某些化合物具有强的荧光发光性能，其荧光发光的颜色分别为 红色（铕化合物，约６１５ｎｍ）和绿色（铽化合物，约５４５ ｎｍ），限制了这类化合物在多色荧光标记生化分析中的应用。 通过将Ｅｕ（ＩＩ１）及Ｔｂ（ＩＩＩ）￣配体４’一苯基一２，２’：６’，２＂－联三吡啶一６，６”一二甲胺四乙酸的荧光配合物同时共价键合到纳米硅胶颗 粒中并调节Ｅｕ（ＩＩＩ）ｆＦｂ（ＩＩＩ）￣合物摩尔比的方法，制备出了可发出红、橙、黄、绿系列颜色荧光的纳米稀土荧光颗粒。 将纳米荧光颗粒标记到链霉亲和素后用于人前列腺特异抗原及病原微生物蓝氏贾地鞭毛虫的时间分辨荧光测定，结果 表明新型纳米稀土荧光颗粒可作为多色荧光标记物用于时间分辨荧光生化测定。 关键词：稀土；纳米荧光颗粒；生物标记；时问分辨荧光；生化分析 中图分类号：ＴＫ０２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３ ７１８０（２００９）０９—０６２１—６ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｎａｎ０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｊｉａｎｇ Ｈｏｎｇｆｅｉ，Ｙｅ Ｚｈｉｑｉａｎｇ，Ｌｉｕ Ｘｉａｏｙｕ，Ｗａｎｇ Ｇｕｉｌａｎ，Ｙｕａｎ Ｊｉｎｇｌｉ （Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄａｌｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｉａｎ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ １ １６０１２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｅｃａｕｓｅ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｒｅ ｍａｉｎｌｙ １ｉｍｉｔｅｄ ｔｏ Ｅｕ ａｎｄ Ｔｂ”ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄ（Ｅｕ． ￣６１５ ｎｍ）ａｎｄ ｇｒｅｅｎ（Ｔｂ，－５４５ ｎｍ）ｅｍｉｓｓｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｎａｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｂｉｏａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｕｓｉｎｇ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｂｉｏｌａｂｅｌｓ ａｒｅ ｒａｒｅｌｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ・ｂｏｕｎｄ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｈｔ ｒｅｄ，ｏｒａｎｇｅ，ｙｅｌｌｏｗ ａｎｄ ｒｇｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｌｏｒｓ Ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ＣＯ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒａｔｉｏｓ ｏｆＥｕ３ 厂ｒｂ” ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｈｔｅ ｌｉｇａｎｄ（４＇－ｐｈｅｎｙｌ一２，２’：６’，２＂－ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅ－６，６＂－ｄｉｙ１）ｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｎｉｔｒｉｌｏ）ｔｅｔｒａｋｉｓ（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ） ｎｉｓｉｄｅ ｔｈｅ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｔｈｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ一１ａｂｅｌｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｉｍｅ—ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ａｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｅｗ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｒａｅ ｕｓｅｆｕｌ ｔｏ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｂｉｏｌａｂｅｌｓ ｆｏｒ ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｂｉｏａｓｓａｙｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ；ｂｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ；ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；ｂｉｏａｓｓａｙ Ｏ引言 Ｅｕ ＿及Ｔｂ 的配合物）作为荧光标记物的时间分辨荧光 生化分析技术（免疫分析技术、核酸杂交分析技术等） 经过２０余年的发展，以稀土荧光化合物（主要为 已经取得了显著的进步，在医学临床诊断及生命科学等 基金项目：国家自然科学基金（２０８３５００１）；高等学校博士学科点专项科研基金（２０Ｏ８０１４ｌ０００３） 作者简介：蒋鸿飞（１９８４一），女，硕士研究生 通信联系人：袁景利，教授，ｊｉｎｇｌｉｙｕａｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ ６２２ 中国科技论文在线Ｓｃｉｅｎｃｅｐａｐｅｒ Ｏｎｌｉｎｅ 第４卷第９期 ２００９年９月 领域中发挥着越来越重要的作用 。基于稀土荧光生物 Ｇ抗体按本研究组以前报道的方法制备 ；配位体４’一 标记物超长荧光寿命（是通常生物背景荧光的１Ｏ ～１ ｏｏ 苯基－２，２’：６’，２”．联三吡啶一６，６＂－二甲胺四乙酸（ＦｒＴＡ）按 倍）的时间分辨荧光生化分析技术可有效消除各种来自 文献报道方法【５ 合成并经元素分析及核磁共振确认；其 样品及仪器的背景信号对荧光测定的干扰，使得测定的 他化学试剂均购自国内试剂公司。 灵敏度得以极大地提高。 １．２仪器 多色荧光标记技术一般采用２个以上具有不同荧光 纳米颗粒的形态及粒径使用ＪＥＯＬ ＪＥＭ一２０００ＥＸ 发光波长的化合物用于生物分子的标记，以同时测定样 透视电镜测定，荧光光谱和荧光寿命使用Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ 品中不同的生物组分或官能团，已在ＤＮＡ序列测定、 ＬＳ ５０Ｂ荧光分光光度计测定，时间分辨荧光免疫测定 多组分荧光生物成像等生命科学领域取得了许多成功 在Ｐｅｒｋｉｎ．Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０多标记记数仪上进行，荧 的应用，其最大的优点是可有效减少分析测定所用的时 光显微成像测定在本研究组研制的倒置式荧光显微镜 间、费用及样品的消耗量。由于稀土荧光化合物中只有 测定［６－７］上进行。 Ｅｕ”及Ｔ 的某些化合物具有强的荧光发光性能，其荧 １．３纳米稀土荧光颗粒的制备 光发光的最大波长分别在约６１５ ｎｍ（铕化合物，红色 将１．８８ ｍｇ的ＰＴＴＡ溶于２０ Ｌ的ｐＨ ９．５的 荧光）和５４５ ｎｌｎ（铽化合物，绿色荧光），限制了这类 ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ碳酸钠缓冲溶液后，加入含有６ ｍｇ ＥＤＣ及 化合物在多色荧光标记时间分辨荧光生化分析中的应 １．２５ ｍｇＮＨＳ的８０ Ｌ无水乙醇溶液，室温下搅拌１ ｈ 用。最近，Ｚｈａｎｇ等 通过将Ｅｕ 及Ｔｂ３＋￣键合在 后加入１．５“Ｌ的ＡＰＳ，室温继续搅拌２ ｈ，然后加入 纳米硅胶颗粒中的方式制备出了具有多色荧光发光的 ２００ Ｌ不同摩尔比的Ｅｕｃｈ－Ｔｂｃｌ３混合溶液（Ｅ 十门ｍ” 纳米稀土荧光颗粒，并探讨了纳米颗粒在时间分辨荧光 的摩尔比分别为：０：１，１：５，１：３，ｌ：１，３：ｌ，５：ｌ， 免疫分析中的应用。但由于该研究制备的纳米稀土荧光 １：０；并控制金属离子总浓度为０．０１５ ｍｏｌ／Ｌ），即得到 颗粒的最大激发波长在２８０ ｎｍ，激发波长太短，限制 键合了稀土荧光配合物的ＡＰＳ溶液。取２００ Ｌ上述溶 了其在生化分析中的有效应用。 液加入到由３．５４ｇ的ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，１１．５８ｇ的环己烷， 本研究采用将２种具有较长最大激发波长及荧光 ２．６４ ｇ的正辛醇及６００ 纯水组成的反相微乳液中，室 量子产率的Ｅｕ３ 及Ｔｂ抖荧光配合物同时键合在硅胶纳 温搅拌０．５ ｈ后，加入２００ 的ＴＥＯＳ及１２０ 的浓氨 米颗粒中并调控颗粒中２种发光物种比例的方法，制 水（２５％、２８０／ｏ）引发聚合，室温下继续搅拌２４ｈ后，加入 备出最大激发波长在３３５ ｎｍ，可分别发出红、橙、黄、 ２０ ｍＬ丙酮破乳，离心收集白色纳米颗粒沉淀，用乙醇 绿等多种颜色荧光的系列纳米稀土荧光颗粒，并探讨 及纯水分别洗涤２次除去纳米颗粒表面吸附的表面活性 了其在生物标记及时间分辨荧光生化分析中的应用。 剂及未反应的原料。 由于这些纳米颗粒的荧光发光均具有长寿命荧光特性 １．４纳米稀土荧光颗粒标记ＳＡ的制备 且激发波长与现用稀土荧光生物标记物相同，预计其 参照本研究组以前建立的方法 Ｊ，将３ ｍｇ牛血 在多色荧光标记时间分辨荧光生化分析领域具有很好 清白蛋白（ＢＳＡ）用ｐＨ７．１的０．１ ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲溶液 的应用前景。 １．２ ｍＬ溶解后，加入１．０ ｍｇ的纳米稀土荧光颗粒及 １实验部分 ０．３ ｍＬ的ｌ％戌二醛水溶液，室温搅拌反应２４ ｈ后离 心收集纳米颗粒，用磷酸缓冲溶液充分洗涤除去未反 １．１试剂 应的ＢＳＡ分子。将经ＢＳＡ表面修饰的纳米颗粒加入 卜乙基一３一（３一二甲基）氨丙基碳酰亚胺盐酸盐 到含有０．４ ｍｇ ＳＡ的０．９ ｍＬ磷酸缓冲溶液中后，加入 （ＥＤＣ）、（３一氨丙基）三乙氧基硅Ｏ ｓ）、 羟基琥珀酰 ０．２ ｍＬ的１％戌二醛水溶液，室温搅拌反应２２ ｈ后加入 亚胺（ＮＨＳ）、四乙基原硅酸四乙￣（ＴＥＯＳ）及Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ ２．０ｍｇ的ＮａＢＨ４，室温下继续反应２ｈ。表面键合有ＳＡ 购自Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ公司；链霉亲和素（ｓＡ）购自 分子的纳米颗粒经离心、磷酸缓冲溶液充分洗涤后， ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ公司；荧光免疫测定用９６微 以ｐＨ８．０的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液为洗脱液， 孔板购自Ｎｕｎｃ公司；人前列腺特异抗原（ＰＳＡ）的鼠单克 用１．０ Ｘ ２９．１ ｃｍ的Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ一５０柱进一步纯化，得 隆抗体、山羊多克隆抗体及兔抗鼠ＩｇＧ抗体购自ＯＥＭ 到２．５ｍＬ纳米颗粒标记的ＳＡ溶液。溶液中加人５．０ｍｇ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ公司；蓝氏贾地鞭毛虫细胞（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ 的ＢＳＡ和２．５ ｍｇ的ＮａＮ３后４℃保存备用。当用于免 ｃｙｓｔｓ）及其鼠单克隆抗体购自Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ． 疫测定时，用含有０．２％ＢＳＡ一０．１％ＮａＮ３・０．９％ＮａＣｌ的 公司；生物素标记山羊抗人ＰＳＡ多克隆抗体及兔抗鼠 ｐＨ７．８的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲溶液适当稀释后使用。 ２００９年９月 第４卷第９期 多色荧光稀土纳米颗粒的制备与应用 ６２３ １．５纳米荧光颗粒标记ＳＡ用于人ＰＳＡ的时间分辨荧 素标记的抗ＰＳＡ多克隆抗体溶液加入到各孔中，３７℃ 光免疫测定 下１ ｈ反应后，用缓冲溶液１洗２次，缓冲溶液２洗１ 用ｐＨ９．６的０．１ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＨＣＯ３缓冲溶液稀释抗 次。将４５ Ｌ纳米粒子标记的ＳＡ溶液加入到各孔中， 人ＰＳＡ单克隆抗体浓度为１０￣ｇ／ｍｈ，取５０ 分注于 ３７℃下１ ｈ反应后，用缓冲溶液ｌ洗４次，然后进行固 ９６微孔板的各孔中，４℃下２４ｈ放置后，用含有０．０５％ 相时间分辨荧光测定。 Ｔｗｅｅｎ ２０的ｐＨ７．８的０．０５ ｍ０１／ＬＴｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液（缓 １．６蓝氏贾地鞭毛虫的荧光成像测定 冲溶液１）洗２次，再用ｐＨ７．８的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣ１ 在１．０ ｍＬ塑料离心管中分别加入２０ ｕＬ抗蓝氏贾 缓冲溶液（缓冲溶液２）冼１次，抗体包被后的微孔板 地鞭毛虫单克隆抗体（５０￣ｔｇ／ｍＬ）、２０ ｇＬ生物素标记兔 ．２０℃下保存。 抗鼠ＩｇＧ抗体（５０￣ｔｇ／ｍｂ、５ 的蓝氏贾地鞭毛虫溶液 用含有５％ＢＳＡ一０．９％ＮａＣ１—０．１％ＮａＮ３的ｐＨ７．８的 （２×１０。ｃｙｓｔｓ／ｍＬ）及５ 的纳米颗粒标记的ＳＡ溶液， ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ．ＨＣ１缓冲溶液稀释人ＰＳＡ抗原溶液制备 室温放置反应２４ ｈ后，离心（５００ ｒ／ａｒｉｎ）收集蓝氏贾地鞭 系列人ＰＳＡ标准溶液，取各标准溶液４５ Ｌ注入上述 毛虫细胞，并用纯水洗涤３次除去未反应的纳米颗粒标 包被后的微孔板的各孔中，３７℃下１ ｈ反应后，用缓 记ＳＡ，离心收集蓝氏贾地鞭毛虫细胞，用少量水稀释 冲溶液１洗２次，缓冲溶液２冼１次。将４５ Ｌ生物 后用于荧光成像测定。 ０ ； 。 ＮＨｔＣｔ｛２￣３Ｓｉ（ＯＥ０３ 厂（’ Ｈ ，Ｎ Ｎ 、（）０ Ｎ ） 、一（、０廿ｌ ＣＯ Ｈ 、 （ ｏ，｝ｔ １）（ ＡｐＳ ———— ■ ————－ “Ｓ ，一Ｃｆ ｝ｕｌ ／－．．－Ｃｆ）２Ｈ ／－－ｃｏ２Ｈ Ｎ Ｎ Ｎ ＼－＿ （），Ｈ ＬＣ（ ｝Ｉ Ｌ（ ２｝１ Ａｐｓ一 Ｉ ｌ Ａ ｃｏＮｕｇａｔｅ ＦＥＯＳ—Ａ ｆ ＮＨ３Ｈ２０ ＮＩ：Ｉ２ ［］ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ 图１ 多彩纳米稀土荧光微粒的制备原理 Ｆｉｇ．１ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ２结果与讨论 蒜 是 嘉蓁 ２．１纳米材料的制备和表征 光及较长的荧光寿命（荧光量子产率：ＰＴＴＡ－Ｅｕ３＋＝１６％， 配体ＰＴＴＡ（结构见图１）是一种联三吡啶的多羧ＰＴＴＡ－Ｔｂ ＋＿ｌ０％；荧光寿命：ＰＴＴＡ－Ｅｕ３＋＝１．２１ ｍｓ， ６２４ 中国科技论文在线Ｓｃｉｅｎｃｅｐａｐｅｒ Ｏｎｌｉｎｅ 第４卷第９期 ２００９年９月 ＰＴＴＡ－Ｔｂ ＋＿０．４５ ｍｓ） 。由于Ｐ１］１Ａ的Ｅｕ３上及Ｔｂ 配合 很好。 物结构中缺少一种能与生物分子共价键合的活性官能 团，导致２种配合物不能作为荧光标记物用于时间分辨 荧光生化测定。本研究通过ＥＤＣ／ＮＨＳ法 先将ＰＴＴＡ Ａ 活化（ＰＴＴＡ的一个羧基在ＥＤＣ的作用下与ＮＨＳ反应 形成具有氨基高反应活幽 ＰＴＴＡ—ＮＨＳ酯，结构见图 雠 １），然后使其与ＡＰＳ共价键合形成ＡＰＳ－ＰＴＴＡ结合体， 瓣筹 该结合体进一步与Ｅ 及Ｔｂｊ＋离子反应即得到用于纳 醯 米荧光颗粒制备的荧光前驱体：ＡＰＳ—ＰＴＩ＇Ａ－Ｅｕ３ 与 图２ ３种代表性纳米稀土荧光颗粒的透射电镜测定结果。 ＡＰＳ．ＰＴＴＡ．Ｔｂ 。然后在由水、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、正辛醇和 （Ａ）Ｅｕ３＋：Ｔｂ 十一１：０；（Ｂ）Ｅｕ３十：Ｔｂ ＝０：ｌ； 环己烷组成的油包水型（Ｗ／Ｏ型）反相微乳液中，用氨 （ｃ）Ｅｕ３＋：Ｔｂ３＋＝ｌ：１（图中插图是单个纳米颗粒的高倍电镜测 水引发荧光前驱体与ＴＥＯＳ及游离ＡＰＳ（存在于荧光前 定结果）。 驱体溶液中）的共聚合即制备出表面带有活性氨基的多 Ｆｉｇ．２ ＴＥＭ ｉｍａｇｅｓ ｏｆｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ 彩稀土荧光纳米颗粒，图１给出了多彩纳米稀土荧光微 ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｅｒｅｎｔ Ｅｕ３ ｒａｔｉｏｓ． 粒的制备原理。 （Ａ）Ｅｕ３十：Ｔｂ ｌ：０；（Ｂ）Ｅｕ ：Ｔｂ ＝０：ｌ； 图２是３种代表『生纳米稀土荧光颗粒（Ｅｕ－Ｔｂ摩尔 （Ｃ）Ｅｕ ：Ｔｂ ＝１：１（ｉｎｓｅｔ ｓｈｏｗｉｎｇａｈｉｇｈｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｉｍａｇｅｏｆ 比分别为：１：０，０：１及１：１）的透射电镜测定结果， 表明采用油包水型反相微乳液法制备的纳米稀土荧光 ｏｎｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ） 颗粒均为形状规则、大小均匀的球状颗粒物，粒径范围 在（５６±４）ｎｎｌ，纳米颗粒之间没有相互粘连，单分散陛 Ｗ＃ｖｅｌｅｎｇｔｈ（ｉｒｍ） 图３各种纳米颗粒在ｐＨ７．８的０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲溶液中的荧光光谱：（Ａ）键合Ｐ兀’Ａ—Ｅｕ 的纳米颗粒（实线）与游离 Ｐ丁ｒＡ—Ｅｕ 配合物（虚线）的激发与发射光谱；（Ｂ）键合Ｐ１ＴＩＡ一１ｂｊ 纳米颗粒（实线）与游离ＰＴｒＡ—Ｔｂ３ 配合物（虚线）的激发与 发射光谱；（Ｃ）键合不同摩尔比Ｐ１ＴＡ—Ｅｕ ＋／ＰＴＴＡ—Ｔｂ 纳米颗粒的发射光谱；（Ｄ）含不同唧一Ｅｕ３￣／ＰＴＴＡ．Ｔｂ 摩尔比纳米颗粒水 溶液在３６５ ｎｍ紫外光照射下的荧光发光（从左到右，Ｅｕ”／ｒｒｂ ：０：１，１：５，１：３，１：１，３：ｌ，５：１，１：０）。 Ｆｉｇ．３ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔａｒｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｎ０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣ１ｂｕｆｆｅｒ ｏｆｐＨ ７．８：（Ａ）ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎａｎｄｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａｏｆｔｈｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＰＴＴＡ—Ｅｕ ｃｏｍｐｌｅｘ（ｓｏｌｉｄ ｌｉｎｅｓ）ａｎｄ ｆｒｅｅ Ｐ１ＴＡ—Ｅｕ ｃｏｍｐｌｅｘ（ｄａｓｈ ｌｉｎｅｓ）；（Ｂ）ｅｘｃｉａｔｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｉ￣ｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａ ｆｏ 第４卷第９期 ２００９年９月 多色荧光稀土纳米颗粒的制备与应用 ６２５ ｔｈｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＰＴＴＡ—Ｔｂ ｃｏｍｐｌｅｘ（ｓｏｌｉｄ ｌｉｎｅｓ）ａｎｄ ｆｒｅｅ ＰＴＴＡ—Ｔｂ ｃｏｍｐｌｅｘ（ｄａｓｈ ｌｉｎｅｓ）；（Ｃ）ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆｔｈｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏｓ ｏｆＰＴＴＡ—Ｅｕ３＋／ＰＴＴＡ．１ｂ３ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ；（Ｄ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｅｓ ｏｆｔｈｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｄｉｆｅｒｅｎｔｍｏｌａｒｒａｔｉｏｓｏｆＰＴＴＡ Ｅｕ３ ／ｐ＇ＩＴＡ－Ｔｂ３ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓｉｎａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｕｎｄｅｒｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｏｆａ３６５ｎｍＵＶｌｉｇｈｔ（ｆｒｏｍｌｅｆｔ ｔｏ ｒｉｇｈｔ，Ｅｕ３ ： ：０：１，１：５，１：３，１：１，３：１，５：１，１：０） 图３给出了采用不同摩尔比ＰＴＴＡ—Ｅｕ ￣ＴｒＡ－Ｔｂ 时制得的纳米荧光颗粒的荧光光谱，纳米颗粒和 ＰＴＴＡ．Ｅｕ ／Ｔｂ 配合物的激发和发射光谱形状十分相 似，最大激发和最大发射波长分别为３３５ １１１１１和６１２ ｎｎｌ， 说明形成纳米颗粒后硅胶基质对配合物的激发和发射 光谱性质没有明显影响，纳米颗粒的最大激发和发射波 长仍然保持了配合物的特征。由于ＰＴＴＡ－Ｅｕ３ 与 ＰＴＴＡ．Ｔｂ 配合物的荧光发射光谱不同，所以当纳米颗 粒中只含有ＰＴＴＡ—Ｅｕ３ 或ＰＴＴＡ－Ｔｂ”配合物时，可得到 与纯ＰＴＴＡ—Ｅｕ 配合物或ＰｒｒＡ． 配合物相同的荧光 ０ＩｕＩＩ｜ｑ磊 嚣 盘皇曩＿｝器搴 搴 宝芷 发射光谱（最大激发为３３５ ｎｌＴｌ，最大发射波长分别为 ６１５ ｒｉｍ及５４５ ｒｉｍ，见图３Ａ、Ｂ）。当纳米颗粒中同时键 合有ＰＴ１、Ａ．Ｅｕ 及ＰＴＴＡ—Ｔｂ”２种配合物时，纳米颗粒 的发射光谱表现为ＰＴＴＡ—Ｅｕ 与ＰＴＴＡ—Ｔｂ”配合物的混 合发射光谱（见图３Ｃ），且各发射峰的强度随着纳米颗 粒中Ｅｕ３ 与 配合物的相对含量变化而变化，在紫外 光照射下，这些纳米颗粒就会呈现出不同颜色的荧光发 光（见图３Ｄ）。在ｐＨ９．１的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ硼酸缓冲溶液中 测得只用铕配合物（ｎ（Ｅｕ）：ｎ（Ｔｂ）＝ｌ：０）及只用铽配合 物（ｎ（Ｅｕ）：ｎ（Ｔｂ）＝０：１）制备的纳米颗粒的荧光寿命 分别为１．２８ ｍｓ和１．２０ ｍｓ，表明纳米颗粒的荧光发 光均具有超长的荧光寿命，可用于百微秒级的时间 分辨荧光测定。 ２－２纳米颗粒作为标记物用于人ＰＳＡ的时间分辨荧光 免疫测定 为了检验纳米颗粒标记ＳＡ后对ＳＡ生物反应学陛 的影响，使用铕配合物纳米颗粒（ｎ（Ｅｕ）：ｎ（Ｔｂ）＝ｌ：０） 标记的ＳＡ对人ＰＳＡ进行了定量时间分辨荧光免疫测 定，所得工作曲线如图４所示。从图４结果可以得出， 在０．１～１０ ｎｇ／ｍＬ的ＰＳＡ浓度范围内，工作曲线具有良 好的线性响应，线性方程可表示为：ｌｏｇ（ｓｉｇｎａ１）＝０．９４３ Ｉｏｇ［ＰＳＡ】＋２．７９６（ｒ＝０．９９７），最低检测下限为０．２ １ ｎｇ／ｍＬ （由本底信号的３倍标准偏差计算得出），测定上限约 为１０ ｎｇ／ｍＬ。该免疫分析结果证明纳米颗粒标记ＳＡ后 ＳＡ仍然保持了良好的生物反应活陛。 图４含铕配合物纳米颗粒标记ＳＡ用于人ＰＳＡ时间分辨 荧光免疫测定的工作曲线 Ｆｉｇ．４ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｍｉｍｍｍｍａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎＰＳＡｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅ ＳＡｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈｔｈｅ ＰＴＴＡ Ｅｕ３ －ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ． ２－３蓝氏贾地鞭毛虫的荧光成像测定 水样品中的蓝氏贾地鞭毛虫细胞分别用３种可分别 发出红、黄及绿色荧光的纳米稀土荧光颗粒（Ｅｕ与Ｔｂ 的摩尔比分别为：１：０，１：１及０：１）标记的ＳＡ进 行选择性免疫荧光染色后，对样品中的蓝氏贾地鞭毛虫 细胞进行了荧光显微镜成像测定，结果如图５所示。 从图５结果可以看出，３种纳米稀土荧光颗粒标记 的ＳＡ均可有效地对蓝氏贾地鞭毛虫细胞进行免疫荧光 染色，染色细胞在荧光显微镜下分别发出与标记物相同 的荧光颜色（图５Ｂ）。另外，由于３种纳米稀土荧光标 记物的荧光发光均具有较长的荧光寿命，当采用时间分 辨荧光成像模式进行测定时，染色细胞仍表现出与常规 荧光成像方式测定时相同的结果见图５（ｃ），且背景信号 大大降低。上述结果表明本研究制备的多彩纳米稀土荧 光颗粒既可用于多色荧光标记的荧光生物显微成像分 析，也可用于多色荧光标记的时间分辨荧光生物显微成 像分析。 ６２６ 中国科技论文在线Ｓｃｉｅｎｃｅｐａｐｅｒ Ｏｎｌｉｎｅ 第４卷第９期 ２００９年９月 Ａ 一一 Ｂ 一一 ｃ一一● 图５经３种纳米稀土荧光颗粒（Ａ，ｎ（Ｅｕ）：ｎ（Ｔｂ）＝ｌ：０；Ｂ，ｎ（Ｅｕ）：ｎ（Ｔｂ）＝ｌ：１；Ｃ，ｎ（Ｅｕ）：ｎ（１１））＝０：１）标记ｓＡ免疫荧光染色 后的蓝氏贾地鞭毛虫细胞荧光显微镜成像测定结果。（ａ）明场成像，（ｂ）荧光成像，（ｃ）时间分辨荧光成像。标尺：１０岬． Ｆｉｇ．５ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｅｓ ｏｆＧｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ ｃｙｓｔｓ ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ａ，ｎ（Ｅｕ）：Ｔｂ＝ｌ：０；Ｂ，ｎ（Ｅｕ）：ｎ（Ｔｂ １：１； Ｃ，ｎ（Ｅｕ）：ｎ（Ｔｂ）＝Ｏ：１）ｌａｂｅｌｅｄ ＳＡ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ．（ａ）Ｂｒｉｇｈｔ－ｉｆｅｌｄ ｉｍａｇｅ；（ｂ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｅ；（ｃ）ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｅ． Ｓｃａｌｅ ｂａｒｓ，１０ Ｂｍ ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｂｉｏａｓｓａｙｓ阴．ＴｒＡＣ－Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ３结论 ２００６，２５（５）：４９０－５００． ３ Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｘｕ Ｙａｎｇ ｅｔ ａ１． ｓｉｌｉｃａ 本研究通过将２种Ｅｕ 及Ｔｂ 荧光配合物同时共价 ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｌａｂｅｌｓ ｏｆｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｏｍｅｌｒｙ 键合在纳米硅胶颗粒中的方式成功地制备出可发出红、 ＩＳ］．Ｃｈｅｍ Ｍａｔｅｒ，２００７，１９（２４）：５８７５—５８８１． 橙、黄、绿系列荧光颜色的新型纳米稀土荧光颗粒，这 ＹｅＺＱ，ＴａｎＭＱ，ＷａｎｇＧ Ｌ，ｅｔａ１．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ 些纳米颗粒具有形状规则，粒径均匀，荧光寿命长及可 ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｐｐｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｌｉｃａ－ｏｃａｔｅｄ ｔｅｒｂｉｕｍ（ＩＩ１） ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｎａｎｏｐａｒｔｉｅｌｅｓ ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００４，７６（３）：５１３－５１８． 简单用于生物分子标记等优点。通过纳米稀土荧光颗粒 Ｌａｔｖａ Ｍ，Ｔａｋａｌｏ Ｈ，Ｍｕｋｋａｌａ Ｖ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅ￣ｖｅｅｎ ｔｈｅ 在生物标记、时间分辨荧光免疫分析及时间分辨荧光生 ｌｏｗｅｓｔ ｔｒｉｐｌｅｔ ｓｔａｔｅ ｅｎｅｌｇｙ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｇａｎｄ ａｎｄ ｌｎａｔｈａｎｉｄｅ（ＩＩ１） 物显微成像分析中的应用研究，证明了新型纳米稀土荧 ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｙｉｅｌｄ叨．Ｊ Ｌｕｍｉｎ，１９９７，７５（２）：１４９－１６９． 光颗粒作为生物标记物在多色荧光标记生物分析领域 ＳｏｎｇＢ，ＷａｎｇＧＬ，ＴａｎＭＱ，ｅｔａ１．Ａｅｕｒｏｐｉｍｕ（Ｉｌ１）ｃｏｍｐｌｅｘａｓ ａｌｌ ｅｆｉｆｃｉｎｅｔ ｓｉｎｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅ ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， 具有很好的应用前景。由于目前对可发出多种荧光颜色 ２００６，１２８【４１）：１３４４２—１３４５０． 的稀土荧光生物标记物还了解较少，相信本研究的结果 Ｗｕ Ｊ１ＷａｎｇＧＬ，Ｊ Ｄ ｅｔａ１．Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｅｕｒｏｐｉｕｍｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｓｅ 可为进一步研制具有更强荧光发光及更多荧光发光颜 ｗｉｈｔ ａｗｉｄｅ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅｆｒｏｍＵＶｔｏｖｉｓｉｂｌｅｌｉｇｈｔｆｏｒｂｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ 色的稀土荧光生物标记物提供一种较好的参考。 ａｎｄ ｔｍｉｅ－ｇａｔｄｅ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ阴．Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ，２００８， （３）：３６５—３６７． ＴａｎＭＱ，ＷａｎｇＧＬ，ＨａｉＸＤ，ｅｔａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ［参考文献］（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ） ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｅｕｒｏｐｉｍｕ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ ｎａｄ ｉｔｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ［１】 Ｙｕａｎ Ｊ Ｌ，Ｗａｎｇ Ｇ Ｌ．Ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘ－ｂａｓｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌａｂｅｌ ｌｆｕｏｍｍｅｔｒｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ．ＪＭａｔｅｒＣｈｅｍ，２００４，１４（１９）：２８９６－２９０１． ｆｏｒｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｂｉｏａｓｓａｙ ．Ｊ Ｆｌｕｏｒｅｓｃ，２００５，１５ （４）：５５９－５６８． ［２】 Ｙｕａｎ Ｊ Ｌ＇Ｗａｎｇ Ｇ Ｌ．Ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ