倾注平板法测定水中细菌菌落总数

实验1 倾注平板法测定水中细菌菌落总数

一、实验目的

了解水中菌落总数测定的意义，原理；熟悉水样的采集与保存；掌握倾注平板法测定水的菌落总数的技术方法，及正确进行结果的卫生评价。 二、实验原理

样品中的微生物细胞充分分散开，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，单个细胞及聚在一起的细胞可以生长繁殖，形成一个肉眼可见的菌落，统计菌落数目，即可用以评价样品中的微生物的数量。

水中细菌菌落总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，37℃经24h培养后所生长的菌落数。用平板菌落计数测定水中细菌菌落总数，仅包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的和兼性厌氧的细菌菌落总数。 三、仪器与试剂

营养琼脂、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、灭菌平皿、放大镜、灭菌采样瓶、灭菌刻度吸管、制备培养基用一般设备:量筒，三角烧瓶，pH计或精密pH试纸等。

四、实验方法

检验程序：

水样

做成几个适当倍数的稀释液

选择2~3个适宜稀释度，各以1ml

分别加入灭菌平皿内，每个浓度

同时做2个平皿。同时做营养琼

脂空白对照。

每皿加入适量营养琼脂

37℃ 24h

菌落计数

报告

操作步骤：

1、检测细菌的水样采集与保存

1）选择容量500ml的磨口带塞无色细口瓶，在采样前必须洗净，瓶口包扎后灭菌备用。

2）按无菌操作采集水样，采水量为瓶容量的80％左右，以便检验时充分摇动，使菌胶团分散。

3）在采集加氯消毒水样时，采样瓶应在消毒前，按每500ml水样加入1.5％硫代硫酸钠溶液2ml，以中和水中的余氯，终止氯的持续杀菌作用；然后，121℃高压灭菌20min备用。

4）水样采集后，应立即记录水样名称、时间、地点等项目，从速检验，一般不应超过2h，置冰箱保存时也不应超过4h。

2、水样的检测

1) 用力振摇水样20～25次，以分散可能存在的菌胶团。

2) 以无菌操作法吸取10ml充分混匀的水样，注入盛有90ml灭菌水的玻璃瓶中，混匀成1:10稀释液。

3）吸取1:10稀释液1ml注入盛有9ml灭菌水试管中，混匀成1:100稀释液，按同法依次稀释成1:1000、1:10000稀释液等备用。吸取不同浓度的稀释液时，每次必须更换吸管。

4）用1ml无菌吸管吸取2～3个适当浓度的稀释液1ml，分别注入无菌平皿中，每个稀释度同时做2个平皿，不同稀释度更换吸管。

5）倾注约15ml己融化并冷却到45℃左右的营养琼脂于上述平皿中，并立即旋转平皿，使水样与琼脂充分混匀。每次检验时另用一个平皿只倾注营养琼脂作空白对照。

6）待平皿内琼脂冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置37℃培养24h。 3、菌落计数

在记下各平板上的菌落数后，应求出同一稀释度的平均菌落数，供计算时使用。在求同一稀释度的平均数时，若其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜计数，应以没有片状菌落生长的平板计数平均菌落数。若片状菌落不到平板的一半，而另一半中菌落分布均匀，则可用计数一半平板上生长的菌落数乘2，代表整个平板上的菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。

不同情况下的计算方法：

1）首先选择平均菌落数在30～300之间者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平均菌落数乘以其稀释倍数报告。

2）若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300之间，则应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应报告菌落的平均数；若比值大于2，应报告其中较少的菌落。

3）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应该按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

5）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

报告方式：菌落数在100以内时，按实有数报告；大于100时，采用两位有效数字乘以10的指数来表示．在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算在报告菌落数为“无法计数”时，应注明水样的稀释倍数。

检验结果记录： 稀释度 平板号 菌落数 平均菌落数 1 10-1 2 1 10-2 2 1 10-3 2 菌落总数 五、结果意义 细菌菌落总数用以说明水被有机物污染的程度。我国生活饮用水卫生标准中规定lml生活饮用水中，细菌菌落总数不得超过100个。 六、注意事项

1、实验开始前，应先将各稀释管、平皿做好标记，包括：稀释度、小组等。 2、进行水样的稀释时，吸管的更换：每支吸管吹打混匀本稀释度的水样，然后吸取1ml水样注入到下一支无菌水管后（不要插入到无菌水中）即弃去，再用新的吸管在下一稀释度重复上述操作。

3、倾注平板前注意琼脂的温度，不要太烫和太凉，否则使细菌烫伤和使琼脂凝固。预先融化的琼脂可放入45℃水浴保温。

4、37℃培养24h后，做平板计数时，可用肉眼观察，必要时可用放大镜检查，以防遗漏。